[发明专利]一种线粒体呼吸链复合物I酶活性检测方法和试剂

说明书

技术领域

本发明属于生物医药技术领域，同时又属于遗传代谢病的临床诊断检测领域。具体而言本发明提供了一种测定线粒体呼吸链复合物I（NADH-Q还原酶，NADH:ubiquinone reductase，EC1.6.5.3）酶活力的方法，同时本发明还提供了作为线粒体呼吸链复合物I（NADH-Q还原酶，NADH:ubiquinone reductase，EC1.6.5.3）的酶活性分析和检测的试剂。 

背景技术

线粒体是真核细胞中的一种细胞器，由两层膜包被,外膜平滑,内膜向内折叠形成嵴, 两层膜之间有腔, 称为膜间隙，线粒体内部是基质。线粒体内膜上具有呼吸链酶系及ATP酶复合体。作为细胞的动力工厂 (power plant)，线粒体是氧化磷酸化功能的唯一执行者，提供了机体所需95%的能量三磷酸腺苷（Adenosine triphosphate, ATP），在新陈代谢和生物能量转换中处于中心地位，对生命机能的维持作用重大。1962年，人类开始认识线粒体疾病，Luft等报道了因线粒体电子传递和ATP合成之间偶联障碍引起的代谢异常病例。1977年Willems等在线粒体病患者发现了肌肉组织细胞色素c氧化酶（Cytochrome C oxidase, COX）活性缺陷，将线粒体疾病与呼吸链酶复合物功能缺陷联系起来。此后，进一步研究发现呼吸链酶复合物功能缺陷与多种脑病和肌肉病相关。1988年，Wallace等首次明确Leber遗传性视神经病（Leber hereditary optic neuropathy, LHON）为线粒体基因（Mitochondrial DNA, mtDNA）突变引起，对线粒体疾病的认识深入到分子水平。迄今研究证实很多脑病、肌病、眼病、帕金森病、Ⅱ型糖尿病、心肌病、肿瘤等疾病及衰老的发生发展与线粒体功能缺陷相关。 

近50余年来，国内外学者对线粒体疾病进行了逐步深入的研究，认识到线粒体病遗传方式的复杂性，致病基因涉及多个核基因和线粒体基因组，临床表现复杂多样，起病急缓不同，可以累及多个脏器、各个年龄人群。由于疾病临床表型和基因型的复杂性，使得临床诊断、病因诊断面临着巨大挑战。对于可疑线粒体病的患者来说，理想的遗传学诊断方法是发现导致线粒体结构和功能缺陷的相关基因突变。但是，基因突变可能在mtDNA上，更多的可能是在发生在核基因（Nuclear DNA, nDNA）上，线粒体病的遗传方式可能为常染色体隐性遗传、X连锁遗传、母系遗传，个别为散在新突变。由于线粒体病涉及基因众多，不可能做到逐一分析。选择常见的线粒体基因位点进行突变和缺失筛查，阳性率很低，大多数患者难以获得准确的病因诊断。 

线粒体呼吸链酶复合物缺陷是线粒体疾病的主要病因，由于能量代谢障碍引起细胞能量不足，导致多系统受累。线粒体呼吸链氧化磷酸化功能障碍所导致的线粒体病临床表现复杂多样，可同时累及多个组织器官，通常以耗能高的器官表现明显，如肌肉、肝脏、神经系统等。造成明显肌肉问题的线粒体病称为线粒体肌病（mitochondrial myopathy），而同时造成明显的肌肉和神经症状的则称为线粒体脑肌病（mitochondrial encephalomyopathy）。发病年龄范围广泛，从新生儿到成人均可发病，临床表现随着年龄的不同而有所不同。神经系统损害主要表现有：智力运动发育落后或倒退、无力、惊厥、肌张力异常、震颤等。Skladal等对75例线粒体呼吸链缺陷患者进行研究，发现肌肉和中枢神经系统最易受累，分别占88%和73%，抽搐31%，眼部损害53%，肝脏损害19%，肾脏损害11%。Debray等研究发现妊娠期异常在线粒体病中表现较为明显，其中低出生体重占20%。本研究中线粒体呼吸链缺陷病患者智力运动倒退、肌张力异常和抽搐是主要的神经系统损害表现，分别为30%、57.5%和32.5%，未发现以上各种临床表现在不同类型的呼吸链酶复合物缺陷中有显著差异（P>0.05），与报道的基本一致；但眼部、肾脏和肝脏损害发生率相对国外报道较低。线粒体呼吸链复合物缺陷患者常表现为特殊的临床综合征，典型线粒体病相关综合征有Leigh综合征、线粒体脑肌病伴高乳酸血症和卒中样发作(Mitochondrial encephalopathy,lacticacidosis, and stroke-like episodes, MELAS)、肌阵挛性癫痫伴破碎红肌纤维病（Myoclonic epilepsy associated with ragged red fibers, MERRF）、Leber 遗传性视神经病（Leber hereditary optic neuropathy, LHON）等。