[发明专利]一种乙酰胆碱酯酶突变体及其应用

说明书

技术领域

本发明属于食品检测、公共卫生领域；更具体地，本发明涉及一种乙酰胆碱酯酶突变体及其应用，其可展示于细胞表面，从而用于有机磷及氨基甲酸酯类农药的高效、快速检测。

背景技术

有机磷及氨基甲酸酯类农药是国内外农业生产中常用的农药类型，其种类多样、杀虫谱广泛、价格低廉，在粮食、蔬菜等农业作物和茶叶等经济作物的生产中应用广泛。此类农药发挥杀虫效应的机制在于其可逆性地抑制了有害昆虫的乙酰胆碱酯酶，形成神经毒性，从而达到除虫的效果。但与此同时，作物中残留的农药如果无法得到有效地去除，同样会对人们的身体健康带来负面的影响，故国内外对农作物中残留的有机磷及氨基甲酸酯类农药的残留限量都有严格的规定。

目前，传统的有机磷及氨基甲酸酯类农药残留的检测方法为色谱学方法及酶抑制法，其中前者虽然检测限低，灵敏度高，但依赖于大型的检测仪器，且样品前处理繁复，不适用于现场快速地检测。酶抑制法利用了有机磷及氨基甲酸酯类农药对乙酰胆碱酯酶的可逆性抑制这一原理，操作简便、反应灵敏，成为应用越来越普遍的农药残留快速检测技术。

不同来源的乙酰胆碱酯酶对有机磷及氨基甲酸酯类农药的灵敏度不同，同时乙酰胆碱酯酶个别氨基酸位点的突变可以有效改善其对某些农药的灵敏度。因此，本领域需要找到更为灵敏和广谱的乙酰胆碱酯酶突变体。

发明内容

本发明的目的在于提供一种乙酰胆碱酯酶突变体及其应用。

在本发明的第一方面，提供一种乙酰胆碱酯酶突变体，所述的乙酰胆碱酯酶突变体的氨基酸序列对应于SEQ ID NO:2氨基酸序列的第408位由Tyr(Y)突变为Phe(F)。

在一个优选例中，所述的乙酰胆碱酯酶是黑腹果蝇乙酰胆碱酯酶。

在本发明的另一方面，提供一种分离的多核苷酸，该多核苷酸选自下组：

(i)编码所述的乙酰胆碱酯酶突变体的多核苷酸；或

(ii)与(i)中的多核苷酸互补的多核苷酸。

在一个优选例中，该多核苷酸具有SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列。

在本发明的另一方面，提供一种基因构建物，所述基因构建物从5’到3’依次包括以下操作性相连的元件：

(a)葡萄糖淀粉酶信号肽编码序列；

(b)乙酰胆碱酯酶突变体片段的编码序列，其编码氨基酸序列如SEQ IDNO:2中第40-622位且其中第408位由Tyr(Y)突变为Phe(F)的乙酰胆碱酯酶突变体片段；和

(c)酵母α凝集素基因C端锚定信号的编码序列。

在一个优选例中，所述的基因构建物中，所述的葡萄糖淀粉酶信号肽编码序列是SEQ ID NO:3所示序列中第1-75位的序列；或

所述的乙酰胆碱酯酶突变体片段的编码序列是SEQ ID NO:3所示序列中第76-1824位的序列；或

所述的酵母α凝集素基因C端锚定信号的编码序列是SEQ ID NO:3所示序列中第1858-2817位的序列。

在另一优选例中，在元件(b)和元件(c)之间，包括一标签蛋白编码序列。

在另一优选例中，所述的标签蛋白是Flag蛋白。

在另一优选例中，所述的元件(a)、(b)和(c)之间包括或不包括连接肽编码序列，所述的连接肽具有1-15aa；较佳地具有1-10aa；更佳地具有1-5aa。

在另一优选例中，所述的基因构建物具有SEQ ID NO:3所示的序列。

在本发明的另一方面，提供一种重组的表达载体，所述表达载体含有前面任一所述的基因构建物。

在另一优选例中，所述的表达载体的骨架质粒是pYES-DEST52。

在本发明的另一方面，提供一种细胞，所述的细胞是酵母细胞，所述细胞中含有所述的表达载体；或其基因组中整合有前面任一所述的基因构建物。

在一个优选例中，所述的酵母细胞选自：酿酒酵母或毕赤酵母。

在另一优选例中，所述的酵母细胞是酿酒酵母细胞。

在本发明的另一方面，提供一种在细胞表面展示表达外源蛋白的方法，所述方法包括：

(i)将前面任一所述的基因构建物导入到酵母细胞中，获得重组细胞；

(ii)培养(i)的重组细胞，从而在细胞表面展示表达外源蛋白。

在本发明的另一方面，提供一种检测待测样品中有机磷或氨基甲酸酯类农药的试剂盒，所述试剂盒中包括：

所述的细胞；或