[发明专利]光敏感基团保护的功能基团亚磷酰胺及其制备方法和应用

说明书

技术领域

本发明涉及亚磷酰胺化合物，尤其涉及光敏感基团保护的功能基团的亚磷酰胺化合物及其制备方法，本发明还涉及该亚磷酰胺化合物在寡聚核苷酸固相合成及5′端功能化中的应用，属于寡聚核苷酸的固相合成及功能化领域。

背景技术

光活性基团指在光子激发下，能够通过形成自由基或异裂中间体，发生化学变化的分子结构。它使在复杂体系中，尤其是在生理环境下，利用光控制小分子或生物大分子的变化成为可能。普遍认为，与温度、酸碱度等其它的调控手段相比，光调控具有定位准确，调控及时，对体系影响小等诸多优点。通常所指的光活性基团可分为两类，即：光异构化基团和光可切除基团。前者的光化学过程是可逆的，后者则是不可逆的化学过程。光可切除基团（caged/caging moieties）的概念最早由J.F.Hoffman于1978年提出1，这类基团对340-370nm范围内的光敏感，能够有效地吸收这种能量的光子。最常见的光可切除基团是邻硝基苯基及其衍生物，此外还有对羟基苯乙酰氧基、香豆素类、呫吨酮乙酸类化合物等。由于邻位硝基的存在，在光激发后，邻硝基苯乙醇类化合物形成五元环状中间体，进而得到邻亚硝基苯乙酮类化合物，与化合物中的其它部分断开。由于邻硝基苯乙醇及其衍生物的结构相比其它光可切除基团在合成中或生理环境下较为稳定，因此在大多数生物体系中被广泛采用，如ATP，DNA，RNA，蛋白质，适配体等。

寡聚核苷酸可以用来做PCR引物，用于核酸序列检测的探针、等位基因特异的寡聚核苷酸分析（Allele-specificoligonucleotide，ASO）、单碱基多样性分析（Single nucleotide polymorphism，SNP）、反义寡聚核苷酸，其在分子生物学领域有广泛的应用。

近几十年来，寡聚核苷酸在分子生物学中发挥着越来越重要的作用，逐渐成为一种非常有效的研究工具。特别是近年来，相关的研究多集中在如何利用寡聚核苷酸从基因水平上研究各种疾病的产生机理及其相关基因的表达网络，并使其通过调节基因的表达量来预防、诊断和治疗相关疾病，作为药物研发的另一种思路。

寡聚核苷酸功能化的传统方法和应用：一般地，5′端的功能化是在寡聚核苷酸合成后加入含磷试剂的小分子带保护基的官能团，脱保护后再经由这些官能团连接其它功能分子。如5′氨基有对甲氧基三苯基（MMTr）保护和三氟乙酰（TFA）保护的模块，选用何种保护基由寡聚核苷酸的后处理决定。连接臂一般为6个碳，12个碳的连接臂用于某些特定情形，如在近距离会发生荧光淬灭的分子内。5′巯基有三苯基（Tr）保护基和二硫键保护两种模块，与MMTr不同，Tr对酸稳定，需小心地用硝酸银将其脱去，过量的硝酸银用TCEP沉淀后离心除去，而此步中过量的TCEP需经脱盐除掉。为保证硫醚键或二硫醚键不被氧化，合成循环中最后一步需用0.2M的碘液。而二硫键保护的模块可用TCEP断开，脱盐后直接使用。末端为巯基的ODN可继续与荧光素、生物素或金属纳米粒结合，用于DNA芯片分析，荧光探针等分子生物学检测。

在一段末端为氨基的寡聚核苷酸中连入含二硫醚的戊酸NHS活化物后能与金、银纳米粒表面结合，形成两个硫-金键，结合的效率可达91%，而单一巯基则仅48%。这种强的DNA-金表面结合模式为DNA控制的纳米粒自组装提供了另一种可行的策略。最初引入5′端磷酸基时需使用含有砜的磷试剂，但如果合成最后DMTr在ODN上，则氨水在会将该保护基脱下暴露磷酸基，这样会给反相HPLC的纯化造成困难。

将邻硝基苄醇结构保护的氨基和羧基与胸腺嘧啶单体的碱基连接，寡聚核苷酸合成后并光照处理后，即可暴露氨基和羧基。在链中加入功能分子还可通过修饰的DNA单体实现，即先将光活性基团连入胸腺嘧啶2′位置进行DNA合成，光脱保护后再连入功能分子。

发明内容

本发明的目的之一是提供一种能够应用于寡聚核苷酸的固相合成及功能化的光敏感基团保护的功能基团的亚磷酰胺化合物；

本发明的目的之二是提供一种合成所述亚磷酰胺化合物的方法；

本发明的目的之三是将所述的亚磷酰胺化合物应用于寡聚核苷酸的固相合成及功能化。

本发明的上述目的是通过以下技术方案来实现的：

应用于寡聚核苷酸固相合成及功能化的光敏感基团保护的功能基团的亚磷酰胺化合物，为式Ⅰ或式Ⅱ所示结构的化合物：