[发明专利]一种人角膜基质细胞系的构建方法

说明书

技术领域

本发明属于角膜细胞培养技术领域，具体涉及一种人角膜基质细胞系的构建方法。

背景技术

人角膜基质层（corneal stroma）由人角膜基质细胞和胶原纤维构成，厚约50-60微米，约占整个角膜厚度的90％，胶原纤维形成200-250个板层，各板层之间相互平行重叠并具有一定的曲率半径，且与角膜表面平行，保证了角膜的透明性。目前研究显示, 临床上很多严重的角膜疾病如深度热烧伤、机械或手术创伤和化学灼伤以及多种病原微生物感染等，均可引起人角膜基质细胞受损，通常会导致角膜水肿和瘢痕形成从而使视力受损，严重者将导致角膜不透明，即引发角膜基质病盲疾病。角膜移植手术是目前角膜基质病盲患者得以治愈的唯一有效手段，但由于捐献的角膜数量极其有限，绝大部分角膜基质病盲患者得不到可用的捐献角膜而无法复明。近一个世纪以来，角膜组织工程技术的快速发展，使组织工程人角膜基质的体外重建及其作为捐献角膜的等效替代物用于临床角膜移植成为可能，也为角膜基质病盲患者通过移植组织工程人角膜基质重见光明创造了条件。但如何在体外获得形态结构和功能正常的大量人角膜基质细胞，一直是组织工程人角膜基质体外重建研究领域的热点和主攻方向。

对人角膜基质细胞的体外培养研究开始于20世纪70年代，Stoesser TR等首次对人角膜基质细胞进行了体外培养。随后，学者们先后对人角膜基质细胞的培养液和体外培养条件进行了研究，发现一些生长因子（Borderie V等，1998）、胎盘聚脱氧核苷酸（Muratore O等，2003）、肝素（Denk PO and Knorr M，1999）等对角膜基质细胞具有一定的促分裂作用，但离细胞系的建立还相距甚远。20世纪90年代，许多学者纷纷利用人乳突淋瘤病毒（Peters DM等，1996）、端粒酶（Jester JV等，2003）、猿猴红疱疹病毒（Manzer AK等，2009）、腺病毒（Yoshiko K等，2010）等对人角膜基质细胞进行了转染研究，获得了可传代培养的角膜基质细胞，甚至获得了几个永生化的细胞系，但由于细胞携带肿瘤病毒癌基因而具有潜在的致瘤性，而无法用于组织工程人角膜基质的体外重建及其临床应用。因此，尽早建立起一种不经过肿瘤病毒癌基因转染的无潜在致瘤性的人角膜基质细胞系，已成为全世界角膜组织工程学家的主攻目标，也是组织工程人角膜基质体外重建成功以及全世界角膜基质病盲患者通过临床移植重见光明的关键。

2005年，樊廷俊等利用眼库捐献角膜成功启动了人角膜内皮细胞的体外培养，并通过改变培养基配方和培养条件成功构出非转染、无致瘤性的人角膜内皮细胞系和人角膜上皮细胞系。2011年，樊廷俊等利用眼库捐献角膜成功启动了人角膜上皮细胞的体外培养，并通过改变培养基配方和培养条件成功构出非转染、无致瘤性的人角膜上皮细胞系。但目前为止，未见有利用人角膜基质组织成功构建出非转染、无致瘤性人角膜基质细胞系的研究报道。

发明内容

本发明的目的是提供一种人角膜基质细胞系的构建方法，从而有效的建立起非转染、无致瘤性的人角膜基质细胞系，为组织工程人角膜基质以及组织工程全层人角膜的规模化体外重建提供足量的人角膜基质细胞。

本发明的构建方法：从眼库中取出人角膜，用0.9%生理盐水清洗后放入超净工作台中，用庆大霉素消毒后用0.9%生理盐水清洗后用眼科镊先后撕下带后弹力层的角膜内皮和带前弹力层的角膜上皮，用无血清DMEM/F12培养液冲洗后用眼科剪把角膜平均剪成8片，用胰蛋白酶浸泡消化后用含有20%胎牛血清的DMEM/F12培养液终止消化，用无血清DMEM/F12培养液冲洗遍后，以每个角膜片朝向后弹力层的面朝下平铺于24孔板的孔底，加入0.1~0.2毫升含有5%胎牛血清的DMEM/F12培养液，置于5%二氧化碳培养箱中、37℃下进行贴板培养12~16小时，将培养液更换为人角膜基质细胞专用培养液继续培养，每3~5天更换新培养液1次，待迁出的细胞长满孔底后去除角膜基质片，用玻璃吸管吸出培养孔中的旧培养液，每孔加入0.1~0.2毫升胰蛋白酶静置消化后吸出酶液，每培养孔中加入1毫升的上述专用培养液，用滴管吹打培养孔底制成人角膜基质细胞悬液；从每培养孔中分别取出0.5毫升细胞悬液，分别加入到2个新的培养孔中，每个培养孔补加上述专用培养液0.5毫升，使之最终体积至1毫升；待人角膜基质细胞再次长成单层后，仍以上述的相同方法进行继代培养。