[发明专利]人源dcf1基因转基因果蝇模型的构建方法

说明书

技术领域

本发明涉及了一种转基因果蝇模型的构建方法，特别是一种人源dcf1基因转基因果蝇模型的构建方法。

背景技术

果蝇（Drosophila melanogaster）具有高度发达的神经系统以及较短的生命周期，易饲养且易于进行遗传学、细胞生物学、分子生物学手段的操作和分析，是一种非常实用的模式生物。所有，果蝇广泛地用于神经退行性疾病模型的构建和研究。

树突状细胞因子（dendritic cell factor 1，DCF1）又名跨膜蛋白59（transmembrane protein 59，TMEM59），首次发现于免疫系统的树突细胞中，是一个表达范围比较广泛的单次跨膜蛋白。目前对于该蛋白的功能研究报道比较少，已有的报道表明DCF1主要定位在高尔基体上，且DCF1与其同源蛋白TMEM59-like能够抑制APP向细胞膜的转运以及进一步的剪切，说明DCF1与AD存在某种联系。

Alzheimer’s disease（AD），又称老年痴呆症，是由一名叫Alois Alzheimer的德国医生于1906年第一次报道的，以不可逆进行性的记忆减退和认知、语言功能障碍以及定向力、运动能力障碍等为主要临床表现的一种神经退行性疾病。AD是老年人的常见病与多发病，全球有超过1500万的老年人正受到AD的侵蚀和折磨。AD严重危害老年人的身心健康，已成为仅次于心脏病、恶性肿瘤和中风的第4位导致老年人死亡的原因，也是老年医学中亟待解决和最棘手的问题之一。AD的发病机制目前学说众多，如自由基损伤学说、胆碱能学说、钙平衡失调学说、兴奋性氨基酸毒性学说等。AD的患者一般表现为皮质神经元丢失，并伴随有细胞外由APP剪切产生的大量β淀粉样肽（amyloid β-peptides, Aβs）沉积形成的老年斑和大量神经细胞内异常过度磷酸化tau蛋白聚集且以双螺旋丝的形式形成神经原纤维缠结（neurofibrillary tangle, NFT）。

发明内容

本发明的目的在于提供一种人源dcf1基因转基因果蝇模型的构建方法。

为达到上述目的，本发明采用如下技术方案：

一种人源dcf1基因转基因果蝇模型的构建方法，其特征在于该方法的具体步骤为：a.将人源dcf1基因开放式阅读框对应的cDNA序列构建入果蝇转基因载体pWIZ中，得到果蝇转基因载体pUAST-dcf1；

b.将步骤a所得果蝇转基因载体pUAST-dcf1为材料，利用显微注射的基因工程技术手段构建并得到人源dcf1转基因果蝇。

上述的步骤a的具体方法可以为：

a-1.以人子宫颈癌细胞HeLa细胞的cDNA为模版进行PCR扩增，引物为：

dcf1 primers：     5’-CGGAATTCATGGCGGCGCCGAAGGGG AG-3’

5’-GCTCTAGATTAAATTTCAGAATGAGCAA-3’)，

得到大小为972bp的dcf1基因开放式阅读框全长的目的片段；再用EcoRI和XbaI双酶切，收集片段；

a-2.用EcoRI和XbaI双酶切空载体质粒pWIZ，收集大片段备用；

a-3.将步骤a-1和步骤a-2所得的两个片段连接起来，得到果蝇转基因载体pUAST-dcf1。

上述的步骤b的具体步骤为：

b-1.将转基因载体pUAST-dcf1（终浓度0.8 μg/mg）和辅助质粒pΔ2-3（终浓度0.2 μg/mg）混合后，将此混合液注入果蝇的受精卵的尾部，并放置在16℃的湿盒中培养；

b-2.待步骤b-1所得的受精卵孵化成幼虫然后羽化为成虫后即和野生型w1118交配，挑取子代眼色为红色的果蝇即为转基因果蝇；

b-3.将步骤b-2所得转基因果蝇和Double Balance果蝇以及野生型w1118杂交，筛选出基因型为w;UAS-dcf1/UAS-dcf1;+/+的果蝇。

本发明利用显微注射基因工程技术和果蝇杂交技术，构建了人源dcf1基因转基因果蝇模型，为相关神经退行性疾病的研究提供了材料和新思路。

附图说明

图1为构建的果蝇转基因载体pUAST-dcf1经限制性内切酶EcoRI和XbaI双酶切产物的电泳图，最左边泳道为DNA Marker，泳道1、2均为pUAST-dcf1双酶切产物。

图2为显微注射操作时果蝇的受精卵的状态。