[发明专利]重组转录激活子样效应因子、转录激活子样效应因子核酸酶及其编码基因及应用

说明书

技术领域

本发明涉及基因工程领域，尤其涉及一对与胰岛素基因识别相关的多肽、一对重组转录激活子样效应因子、一对转录激活子样效应因子核酸酶及其编码基因与应用。 

背景技术

人insulin基因是人胰岛素编码基因。胰岛素是由胰岛β细胞受内源性或外源性物质如葡萄糖、乳糖、核糖、精氨酸、胰高血糖素等的刺激而分泌的一种蛋白质激素。胰岛素是机体内唯一降低血糖的激素，同时促进糖原、脂肪、蛋白质合成.胰岛β细胞受损,胰岛素分泌不正常会引起糖尿病.糖尿病（diabetes）是胰岛功能减退、胰岛素抵抗等而引发的糖、蛋白质、脂肪、水和电解质等一系列代谢紊乱综合征，临床上以高血糖为主要特点，典型病例可出现多尿、多饮、多食、消瘦等表现，即“三多一少”症状，糖尿病（血糖）一旦控制不好会引发并发症，导致肾、眼、足等部位的衰竭病变，且无法治愈。对内源胰岛素基因进行定向基因修饰有利于胰岛素基因功能,糖尿病发病机理和胰岛β细胞定向分化的研究. 

按照人类的意愿对基因组进行定向靶向修饰一直是许多科学家的梦想。在内源的基因组上特异地删除或加入我们需要的序列，一方面可以构建出各种动物模型用于生物学基础研究和疾病机理研究，另一方面可以生产动物反应器用以廉价生产我们需要的又很难从其他途径得到的生物组分。 

人们一直没有找到简单高效的方法对基因组进行基因组靶向修饰。传统的基因打靶技术依赖于细胞内自然发生的同源染色体随机交换，其打靶效率非常低，通常只有10^-6-10^-8，这种打靶方法只在小鼠中得到了广泛了应用，而在其他模式动物及大型哺乳动物中都因效率太低而得不到广泛应用。 

近年发展很快的序列特异的核酸酶可以用于精确的基因组靶向修饰。一般由序列特异的核酸酶由一个DNA识别结构域和一个非特异性核酸内切酶结构域构成。原理是首先由DNA识别域把核酸酶定位到需要编辑的基因组区域，然后非特异性核酸内切酶切断双链DNA从而造成DNA双链断裂（double-strand break，DSB），引入的DSB激活的DNA自我修复可以引起基因的突变和促进该位点DNA同源重组。锌指核酸酶（Zinc-finger nucleases，ZFN）是现在研究最清楚也是应用最广的序列特异的核酸酶。其原理是两个锌指蛋白特异识别两段相隔5-7bp的DNA序列，并把与之融合表达的非特异性DNA切割蛋白Fok1的两个单聚体定位到了一起，DNA切割蛋白形成双聚体时可以切断该位置的双链DNA，从而造成DSB。ZFN的出现使基因组靶向修饰技术向前迈进了一大步，然而，ZFN技术还存在靶向不确定性、效率低、拖把率高等问题，研究者很难自行设计出特异和高效的靶向基因组目的序列的锌指核酸酶仍然是制约ZFN广泛应用的瓶颈。而商业购买高效特异的锌指核酸酶又价格昂贵（20万人民币/基因），一般研究者或商业公司根本无法承受这笔费用。 

2009年两个研究组发现植物病原体Xanthomonas中的一种可以调节植物基因表达的转录激活子样效应因子（transcription activator-like effector，TALE）表现出DNA结合特异性，而其识别密码具有模块化和简单化的特点，为科学家们开发出更简易的新型基因组靶向修饰技术带来了新希望。 

TALE与Fok1融合后即形成转录激活子样效应因子核酸酶（transcription activator-like effector nucleases，TALEN）。TALEN的打靶原理与ZFN相同，只是识别特异DNA的蛋白不同。TALEs由数十个特异性识别DNA的串联“蛋白模块”和两侧的N-末端及C-末端序列组成。每个“蛋白模块”包含34个氨基酸，第12和13位残基是靶向识别的关键位点，被称作重复可变的di-residues（RVDs）位点。然而不同于每个锌指蛋白识别特异性的三联体碱基，TALEs上的每个RVDs仅能识别一个碱基。 

Sangamo BioSciences公司和哈佛大学的两个研究小组分别利用TALEs技术进行了基因组靶向修饰相关研究，两篇研究论文发表在同一期的《自然生物技术》（Nature Biotechnology）杂志上。