[发明专利]果蝇视网膜发育模型的体外培养系统及其应用

说明书

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种果蝇视网膜发育模型的体外培养系统，及其在视网膜发育相关基因和药物筛选中的应用。

背景技术

果蝇由于其饲养方法简单低廉，繁殖迅速且大量，基因组精简清晰便于研究，遗传手段较多且操作简便等优点，被科学界公认为一种优良的模式生物。自从20世纪初，摩尔根利用果蝇证实了孟德尔定律，提出了遗传学第三定律-“连锁与交换定律”并因此获得1933年诺贝尔医学和生理学奖之后，基于果蝇的研究逐步揭示了胚胎发生和器官发育的分子调控机理。经大批科学家长时间的研究成果证实，果蝇中发现的大多数发育机理，在哺乳动物(包括人类)中有高度的保守性。

果蝇的复眼尽管和人眼在形态上有很大的差别，但它们都是由晶状体，色素层(巩膜)和视网膜这三种基本的成像结构组成。任何一部分结构的发育异常都是致盲的。视网膜发育相关的重要基因和信号通路，大多在果蝇中最先发现。比如著名的Wnt信号通路，它几乎调控眼睛发育所有步骤(包括胚胎期眼睛区域决定，眼睛形态发生，细胞增殖分化和凋亡，视网膜神经形成和生长等等)，就是最先在果蝇中发现的。随后在果蝇中的相关研究帮助科学家们理解了哺乳动物中的Wnt通路，而果蝇中的这些成果也因此获得了1995年诺贝尔医学和生理学奖。随后的大量研究表明，这些重要基因和信号通路在人类中同样影响包括眼睛在内的多种器官发育；而相关基因的异常调控和表达，会造成各种器官发育异常，甚至导致肿瘤生成和转移。如今，果蝇视网膜已经发展为一种理想的人类眼部疾病模型，应用于研究常染色体显性遗传视网膜色素变性(Autosomal Dominant Retinitis Pigmentosa)这类遗传性眼部疾病，以及亨廷顿氏舞蹈症(Huntington′s Disease)，帕金森病(Parkinson′s disease)和阿尔茨海默病(Alzheimer’s Disease)等神经退化性疾病引发的视觉功能退化。因此，探索果蝇视网膜早期发育的过程，对于揭示人类眼睛等器官发育的细胞和分子机理，阐释各种眼部疾病的发病机理，以及药物筛选和毒理学评价等领域都有十分重要的意义。

目前对果蝇视网膜早期发育过程的理解，还停留在上世纪90年代初期。Wolff，Ready，Cagan等科学家通过对果蝇视网膜固定片的观察，推测了视网膜每隔两小时的发育进程，提出了关于视网膜形态发育(Morphogenesis)方式的一些假说。然而，由于早期视网膜发育过程无法在体内进行观察，也缺少有效的体外培养方法，所以其两小时内的实时发育细节至今还没有能够弄清，关于视网膜形态发育过程的假说也依然只是猜测。

发明内容

本发明的第一个目的是建立一种能够实时追踪记录果蝇视网膜早期发育模型的体外培养系统，具体技术方案包括以下步骤：

1.配制用于果蝇视网膜体外培养的器官培养液，器官培养液由体积百分含量的以下组分构成：89％昆虫细胞培养基(Schneider’s Drosophila medium)、10％热灭活胎牛血清(heat-inactivated feral bovine serum)、1％青霉素-链霉素混合溶液(penicillin/streptomycin)，0.2mg/ml胰岛素(insulin)。

2.室温条件下，在器官培养液中解剖分离出含有荧光标记(如E-cadherin-GFP)的果蝇三龄后期幼虫视网膜，将其取出并完全浸透于透气底膜(Lumox dish，Sigma)上的新鲜培养液中，加盖四周涂有聚三氟氯乙烯(Halocarbon 700oil)的盖玻片(18X18mm)，使视网膜稳固封闭于“透气底膜-盖玻片-聚三氟氯乙烯-器官培养液”所构成的厚度约0.3-0.6mm的液体腔内。

3.运用激光共聚焦显微镜实时监测视网膜发育进程。选取物镜为60倍或100倍，激光强度设定为0.1％-10％，每隔10分钟(或其他大于10分钟且小于3小时的间隔时间)调整焦距至图像清晰，扫描采集并分析视网膜形态发育过程。

本发明的第二个目的是提供一种快速筛选与视网膜早期发育相关基因的方法，具体技术方案如下：

1.将含有某突变基因(a^-)的果蝇与含有荧光标记基因(如E-cadherin-GFP)的果蝇交配，整合出如下基因型的果蝇：E-cadherin-GFP；a^-。