[发明专利]共转orca3/g10h基因提高长春花中长春花类生物碱含量的方法

权利要求书

1.一种共转orca3/g10h基因提高长春花中长春花类生物碱含量的方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：

（1）采用基因克隆方法获得orca3和g10h基因；

（2）分别构建CaMV 35S-orca3-nos terminator和CaMV 35S-g10h-nos terminator的表达盒，然后依次将所述表达盒置于双元表达载体pCAMBIA2300中，构建成含orca3和g10h基因的植物双元表达载体pCAMBIA2300+g10h+orca3；

（3）将所述植物双元表达载体pCAMBIA2300+g10h+orca3通过冻融法转化根癌农杆菌，获得含pCAMBIA2300+g10h+orca3的根癌农杆菌工程菌；

（4）将所述工程菌转化长春花并再生出植株。

2.根据权利要求1所述的共转orca3/g10h基因提高长春花中长春花类生物碱含量的方法，其特征在于，在所述步骤（1）中，从长春花基因组中克隆所述orca3基因时采用的上游引物为ORCA3-F1，其序列为5’-ACTAGTATGTCCGAAGAAATCAT-3’，下游引物为ORCA3-R1，其序列为5’-GGTCACCTTAATATCGTCTCTTCT-3’；从长春花基因组中克隆所述g10h基因时采用的上游引物为G10H-F1，其序列为5’-ACCAGTATGGATTACCTTACCAT-3’，下游引物为G10H-R1，其序列为5’-GGTCACCAAGGGTGCTTGGTACAGC-3’。

3.根据权利要求1所述的共转orca3/g10h基因提高长春花中长春花类生物碱含量的方法，其特征在于，在所述步骤（3）中，所述根癌农杆菌为EHA105。

4.根据权利要求1所述的共转orca3/g10h基因提高长春花中长春花类生物碱含量的方法，其特征在于，所述步骤（4）中，所述转化包括以下步骤：

（1）预培养长春花的外植体；

（2）共培养所述工程菌与所述外植体；

（3）诱导共培养后的长春花的愈伤组织及不定芽分化；

（4）诱导生根和移栽所述长春花植株。

5.根据权利要求1所的共转orca3/g10h基因提高长春花中长春花类生物碱含量的方法，其特征在于，在所述步骤（4）之后还包括以下步骤：PCR检测目的基因orca3/g10h的整合情况；HPLC-ELSD测定所述转基因长春花中长春花类生物碱的含量，筛选获得生物碱类含量提高的转基因长春花植株。

6.根据权利要求5所述的共转orca3/g10h基因提高长春花中长春花类生物碱含量的方法，其特征在于，所述PCR检测的步骤为：先设计合成35s-f/orca3-r和35s-f/g10h-r引物，再进行DNA扩增，然后在紫外线下观察到目的条带的阳性株系即为所述转基因长春花植株。

7.根据权利要求6所述的共转orca3/g10h基因提高长春花中长春花类生物碱含量的方法，其特征在于：

所述引物35s-f的序列为5’-CGCACAATCCCACTATCCTT-3’；

所述引物orca3-r的序列为5’-GCCCTTATACCGGTTCCAAT-3’；

所述引物g10h-r的序列为5’-TGAATTCCTTGGCAGAATCC-3’。

8.根据权利要求5所述的共转orca3/g10h基因提高长春花中长春花类生物碱含量的方法，其特征在于，所述HPLC-ELSD测定长春花中生物碱含量的方法为：当所述转基因长春花株高生长到15cm时，选取幼嫩的叶片，于50℃烘箱中烘至恒重，然后磨成粉末；称取0.1g所述干粉于2mL Eppendorf管中，加入1mL甲醇，浸泡3h，然后用超声波40W处理30min，5000rpm离心10min，取上清用0.4μm的滤膜过滤，即可用于HPLC检测长春花生物碱的含量；所述HPLC的流动相采用体积比为7:9:6的乙腈、甲醇和0.7%二乙胺，所述二乙胺用磷酸调整到pH值为7.2，所述流动相的流速为1.0mL/min，柱温为35℃，所述ELSD检测系统的漂移管温度为35℃，放大系数为7，载气压力为5bar；根据标准品的浓度和峰面积计算出样品中的文多灵、长春质碱和长春碱的重量含量，再除以样品的叶片干重，即可计算出文多灵、长春质碱和长春碱占样品干重的百分含量。