[发明专利]共转orca3/g10h基因提高长春花中长春花类生物碱含量的方法

说明书

技术领域

本发明涉及的是一种生物技术领域的提高长春花类生物碱含量的方法，特别是一种共转orca3/g10h基因提高长春花中长春花类生物碱含量的方法。

背景技术

长春花(Catharanthus roseus)属夹竹桃科多年生草本植物，可产生100多种具有抗癌活性的萜类吲哚生物碱(Terpenoid Indole Alkaloids,TIAs)。其中，长春碱(Vinblastine)和长春新碱(Vincristine)是重要的抗肿瘤药用成分，也是目前应用最为广泛的天然抗癌药用成分。还有抗过敏药用成分利血平(Reserpine)和降压药用成分阿玛碱(Ajmalicine)等。其中长春瑞宾是Pierre Fabre公司在20世纪90年代中期开发的一种比较新型的长春花生物碱类药物，它是长春碱的一种半合成衍生物，是由一类长春花属植物(Vinca rosea)所含的文多灵（Vindoline）和长春质碱（Catharanthine）化学半合成而来的一种药物，目前在临床上应用于治疗乳腺癌、睾丸癌、卵巢上皮细胞癌、非小细胞性肺癌疗效显著。因此，长春花被认为是一种具有很高开发应用价值的药用植物。

然而，由于这些药物在长春花中的含量极其微少（仅为百万分之几至十万分之几），所以从天然植物中提取TIAs远远不能满足市场需求，导致长春花药用成分的供需矛盾相当严重（每年只能生产12kg长春碱和1kg长春新碱），使其价格极为昂贵（高达6000美元/克），而用化学合成和半合成因成本太高而不具有商业价值。目前，全国市场上的长春花生物碱纯品主要依靠进口。生物技术的兴起和发展，为定向提高长春花中有效药用成分含量及实现长春花生物碱的规模化生产提供了新的有效手段，从而已引起国内外的广泛重视。

发明内容

本发明的目的在于克服现有技术中的不足，提供一种共转orca3/g10h基因提高长春花中长春花类生物碱含量的方法。本发明涉及的技术主要包括关键酶基因克隆、载体构建、遗传转化、分子检测、生物碱提取及含量测定，建立了稳定提高长春花中部分生物碱含量的方法，为利用长春花大规模生产长春花类生物碱奠定坚实的基础。

本发明是通过以下技术方案实现：

一种共转orca3/g10h基因提高长春花中长春花类生物碱含量的方法，该方法包括如下步骤：

（1）采用基因克隆方法获得orca3和g10h基因；

（2）分别构建CaMV 35S-orca3-nos terminator和CaMV 35S-g10h-nos terminator的表达盒，然后依次将所述表达盒置于双元表达载体pCAMBIA2300中，构建成含orca3和g10h基因的植物双元表达载体pCAMBIA2300+g10h+orca3；

（3）将所述植物双元表达载体pCAMBIA2300+g10h+orca3通过冻融法转化根癌农杆菌，获得含pCAMBIA2300+g10h+orca3的根癌农杆菌工程菌；

（4）将所述工程菌转化长春花并再生出植株，即得共转orca3/g10h基因的长春花植株。

优选的，在所述步骤（1）中，从长春花基因组中克隆所述orca3基因时采用的上游引物为ORCA3-F1，其序列为5’-ACTAGTATGTCCGAAGAAATCAT-3’，下游引物为ORCA3-R1，其序列为5’-GGTCACCTTAATATCGTCTCTTCT-3’；从长春花基因组中克隆所述g10h基因时采用的上游引物为G10H-F1，其序列为5’-ACCAGTATGGATTACCTTACCAT-3’，下游引物为G10H-R1，其序列为5’-GGTCACCAAGGGTGCTTGGTACAGC-3’。

优选的，在所述步骤（3）中，所述根癌农杆菌为EHA105。

优选的，在所述步骤（4）中，所述转化包括以下步骤：

（1）预培养长春花的外植体；

（2）共培养所述工程菌与所述外植体；

（3）诱导共培养后的长春花的愈伤组织及不定芽分化；

（4）诱导生根和移栽所述长春花植株。