[发明专利]一种新型细胞因子融合蛋白IP10单链抗体的制备方法

权利要求书

1.一种新型细胞因子融合蛋白IP10单链抗体的制备方法，其特征在于，所述制备方法包括以下步骤：

S1、根据基因库合成人源性IP10胞外端编码基因；

S2、利用重组噬菌体抗体系统构建抗表皮生长因子受体突变体III的单链抗体，并测定其基因序列；

S3、对(Gly₄Ser)₃柔性接头进行胸腺嘧啶-腺嘌呤序列替换部分鸟嘌呤-胞嘧啶序列的优化合成，并克隆于真核表达载体中；

S4、将所述IP10胞外端编码基因和抗表皮生长因子受体突变体III的单链抗体基因依次克隆于所述真核表达载体中，并通过所述优化合成的(Gly₄Ser)₃柔性接头相连接，获得IP10单链抗体的编码基因；

S5、将所述IP10单链抗体的编码基因在大肠杆菌中表达，获得IP10单链抗体。

2.根据权利要求1所述的新型细胞因子融合蛋白IP10单链抗体的制备方法，其特征在于，步骤S1包括：

S1-1、根据基因库查找到人源性IP10的基因序列，通过人工基因合成的方式，合成IP10的胞外端编码基因；

S1-2、将步骤S1-1获得的人源性IP10胞外端编码基因克隆入T载体。

3.根据权利要求2所述的新型细胞因子融合蛋白IP10单链抗体的制备方法，其特征在于，所述步骤S2包括：

S2-1、取表皮生长因子受体突变体III免疫小鼠脾淋巴细胞，应用RT-PCR方法分别扩增小鼠抗体重链可变区和轻链可变区基因，用重叠延伸连接法将编码(Gly₄Ser)₃柔性接头的接头序列连接所述重链可变区和轻链可变区基因，并克隆入噬粒载体pCANTAB5E，得到重组噬粒；

S2-2、以所述重组噬粒转化大肠杆菌TG1细胞，与辅助噬菌体M13K07体内重组，构建噬菌体单链抗体库；

S2-3、用表皮生长因子受体突变体III抗原在所述噬菌体单链抗体库中筛选出高结合力的阳性重组噬菌体，并对所筛选阳性重组噬菌体的单链抗体基因片段进行克隆和序列测定，获得抗表皮生长因子受体突变体III的单链抗体基因序列。

4.根据权利要求3所述的新型细胞因子融合蛋白IP10单链抗体制备方法，其特征在于，所述步骤S3包括：

S3-1、合成(Gly₄Ser)₃柔性接头的肽段，用胸腺嘧啶-腺嘌呤序列替换部分重复率较高的鸟嘌呤-胞嘧啶序列；

S3-2、在肽段的3’端加入多聚组氨酸标签序列及限制性内切酶Xhol I和EcoR I位点；

S3-3、进行PCR反应，参数为：以94°C预变性3-5分钟、94°C变性30-60秒、50-58°C退火1分钟、70-73°C延伸1分钟为一次循环，进行30-34个循环，70-72°C延伸5-10分钟；

S3-4、PCR产物经Xhol I/EcoR I双酶切后，回收并克隆入重组质粒pcDNA3中。

5.根据权利要求4所述的新型细胞因子融合蛋白IP10单链抗体制备方法，其特征在于，所述步骤S4中所述真核表达载体为所述步骤S3-4克隆后的重组质粒pcDNA3。

6.根据权利要求5所述的新型细胞因子融合蛋白IP10单链抗体制备方法，其特征在于，所述步骤S5包括：将所述IP10单链抗体的编码基因亚克隆于pET28a载体质粒，并在大肠杆菌中表达，进一步通过体外蛋白复性获得生物学活性的IP10单链抗体。

7.根据权利要求3所述的新型细胞因子融合蛋白IP10单链抗体的制备方法，其特征在于，步骤S2-3所述高结合力的判定依据为：用表皮生长因子受体突变体III的抗原肽包被酶联免疫吸附实验的酶标板，同时加入辣根过氧化物酶标记的抗M13噬菌体抗体37°C孵育后，以表皮生长因子受体突变体III单克隆抗体和磷酸缓冲液作为阳性和阴性对照，加入显色液后，酶标仪测定405nm波长处吸光值，比阴性对照组值高2倍判断为高结合力。

8.一种新型细胞因子融合蛋白IP10单链抗体，其特征在于，所述IP10单链抗体是通过权利要求1-7中任意一项所述的IP10单链抗体的制备方法制得。