[发明专利]一种新型细胞因子融合蛋白IP10单链抗体的制备方法

说明书

技术领域

本发明属于医学领域，具体涉及一种新型细胞因子融合蛋白——趋化因子干扰素诱导蛋白10（IP10）单链抗体的制备方法，及其体内活性检测方法。

背景技术

尽管有手术、放疗和化疗等综合治疗手段，在过去20多年，恶性脑胶质瘤特别是多形胶质母细胞瘤的预后并无明显改善，免疫治疗通过激发和补充机体的抗肿瘤免疫能力来杀灭肿瘤细胞，具有特异性强、毒副反应轻和长期记忆等特点，对于靶向清除侵润的残余肿瘤细胞是一种较理想的辅助治疗策略。过去认为中枢神经系统是免疫豁免区，免疫治疗难以奏效，但近年来越来越多的证据提示中枢神经系统并非免疫豁免区，有研究证实被激活的淋巴细胞可以穿过血脑屏障（Sehgal A,Berger MS.Basic concepts of immunology and neuroimmunology.Neurosurg Focus.2000,9(6):1-6）。这使针对胶质瘤的免疫辅助治疗成为可能。随着胶质瘤特异性抗原被相继发现和鉴定，胶质瘤特异性细胞毒性T淋巴细胞（CTL）过继疗法成为最令人瞩目的生物治疗研究领域之一。多年来对脑胶质瘤免疫治疗的研究发现动物实验和临床疗效欠佳，其主要原因为靶向募集到脑胶质瘤细胞部位的胶质瘤特异性CTL的细胞数量有限。

IP10属于CXC类的趋化因子，不但具有抗肿瘤血管作用，而且可以定向募集T淋巴细胞并促进淋巴细胞活化和增殖，引起肿瘤内淋巴细胞浸润，显示出强大的抗肿瘤潜力。近年来有研究表明过继肿瘤抗原特异性CTL能够介导有效的抗神经系统肿瘤免疫效应，其中趋化因子IP10发挥了关键作用（Nishimura F,Dusak JE,Eguchi J,et al.Adoptive Transfer of Type 1 CTL Mediates Effective Anti-Central Nervous System Tumor Response:Critical Roles of IFN-Inducible Protein-10.Cancer Res.2006,66:4478-4487）。经典的树突状细胞（DC）与肿瘤裂解产物混合培养制备CTL在体内由于肿瘤免疫逃逸机制以及肿瘤免疫原性低等原因，其杀伤作用受到较大限制（Riddell SR.Engineering antitumor immunity by T-cell adoptive immunotherapy.Hematology Am Soc Hematol Educ Program.2007,2007:250-256）。因此，借助IP10的趋化作用，CTL即可从注射部位靶向富集到肿瘤周围特别是浸润的肿瘤细胞周围。

IP10靶向募集足够数量胶质瘤特异性CTL到胶质瘤细胞部位的前提是胶质瘤细胞部位（而非IP10肿瘤注射部位）要有足够浓度的IP10。目前主要通过转基因技术或者直接肿瘤局部多点注射等方法使肿瘤富集IP10，前者存在靶向性问题，后者仅能提高注射部位的浓度，而不能选择性提高肿瘤细胞部位特别是浸润于脑组织的肿瘤细胞部位的IP10浓度，不适合用于辅助治疗这种具有侵袭性生长特性的胶质瘤。

发明内容

本发明要解决的技术问题在于，针对现有技术不能有效在肿瘤细胞部位富集IP10的问题，提供一种针对脑胶质瘤的新型特异性细胞因子融合蛋白——IP10单链抗体（IP10-scFv），其不仅可以特异性靶向结合脑胶质瘤细胞，而且可以激活体内的淋巴细胞定向募集到胶质瘤细胞周围，参与歼灭肿瘤细胞，对临床上胶质瘤的治疗和预防其复发起到根本作用。

本发明第一方面提供了一种新型细胞因子融合蛋白IP10单链抗体的制备方法，其特征在于，所述制备方法包括以下步骤：

S1、根据基因库合成人源性IP10胞外端编码基因；

S2、利用重组噬菌体抗体系统构建抗表皮生长因子受体突变体III的单链抗体，并测定其基因序列；

S3、对(Gly₄Ser)₃柔性接头进行胸腺嘧啶-腺嘌呤序列替换部分鸟嘌呤-胞嘧啶序列的优化合成，并克隆于真核表达载体中；

S4、将所述IP10胞外端编码基因和抗表皮生长因子受体突变体III的单链抗体基因依次克隆于所述真核表达载体中，并通过所述优化合成的(Gly₄Ser)₃柔性接头相连接，获得IP10单链抗体的编码基因；

S5、将所述IP10单链抗体的编码基因在大肠杆菌中表达，获得IP10单链抗体。