[发明专利]一种用于快速基因克隆的酶混合物及制备方法、包含该酶混合物的试剂盒

权利要求书

1.一种用于快速基因克隆的酶混合物，其特征在于，该酶混合物由Redα蛋白，Redβ蛋白和Gam蛋白组成，在该酶混合物中，三种蛋白的混合比例如下：Redα蛋白的浓度为3ng/μl；Redβ蛋白的浓度为150ng/μl-1500ng/μl；Gam蛋白的浓度为3ng/μl-300ng/μl。

2.一种含有权利要求1所述酶混合物的试剂盒。

3.如权利要求2所述的试剂盒，其特征在于，该试剂盒还包括如下反应缓冲液：100-500mM的Tris-Hcl，100mM的MgCl2，10mM的ATP，5-10mM的DTT，0-0.5%mM的BSA。

4.一种如权利要求1所述的用于快速基因克隆的酶混合物的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：

（1）Redα，Redβ和Gam蛋白表达菌株的获得：全基因合成Redα，Redβ和Gam蛋白的DNA序列，合成Redα，Redβ和Gam蛋白的引物，以合成好的基因为模板，用对应的引物PCR获得的产物Nde1和Xho1双酶切后连接到用相同的酶酶切好的Pet30a载体上，转化DH5a，测序获得正确的阳性表达质粒：pet30a-Redα，pet30a-Redβ，pet30a-Gam；然后这三种质粒转化BL21（DE3），获得表达菌株；

（2）Redα，Redβ和Gam蛋白的表达和纯化：步骤（1）获得的表达菌株接种到LB培养基中培养，进行诱导表达，离心收菌，进行超声破菌，离心收集上清；过Ni柱纯化，阴离子柱纯化，得到纯化后的Redα，Redβ和Gam蛋白。

5.如权利要求4所述的方法，其特征在于，步骤（1）中，所述的引物序列为：

reda nde F：5’-ccgCATATGACACCGGACATTATCC-3’（SEQ ID NO.1），

reda xho R：’-ccgCTCGAGTCGCCATTGCTCCCCAAATAC-3’（SEQ ID NO.2）；

redb nde F：5’-ccgCATATGAGTACTGCACTCGCAAC-3’（SEQ ID NO.3），

redb xho R：5’-ccgCTCGAGTGCTGCCACCTTCTGCTC-3’（SEQ ID NO.4）；

gam nde F：5’-ccgCATATGGATATTAATACTG-3’（SEQ ID NO.5），

gam xho R：5’-ccgGATATTGATTCAGAGGTACTCGAG-3’（SEQ ID NO.6）。

6.如权利要求4所述的方法，其特征在于，步骤（2）具体为：将步骤（1）获得的表达菌株1：100接种到LB培养基中，37℃，250rmp震荡培养到OD600=0.6时，加入1mMIPTG诱导表达，同时将培养温度降至20℃，低温诱导表达过夜，5k转离心收菌；1g菌体加入10ml缓冲液，超声破菌；12k转离心30min收集上清，过Ni柱纯化；阴离子柱纯化。

7.如权利要求4或6所述的方法，其特征在于，所述过Ni柱纯化具体包括如下步骤：

第一步平衡：用平衡缓冲液平衡柱子，直至pH达到8.0，紫外检测读数为5~10个柱体积，检测调零后上样；

第二步上样：样品应保持澄清，如发现沉淀浑浊则需要离心，收集流出；

第三步平衡：上样结束，用平衡缓冲液平衡层析柱，直到紫外检测读数回到基线或相对稳定；

第四步预洗：用预洗缓冲液预洗，收集洗脱组分；

第五步洗脱：用洗脱液洗脱目标蛋白，收集洗脱组分；

第六步洗柱：用洗柱缓冲液冲洗层析柱，收集洗脱组分。

8.如权利要求4或6所述的方法，其特征在于，所述阴离子柱纯化具体包括如下步骤：

第一步平衡：用缓冲液平衡柱子，直至pH达到8.0，紫外检测读数为5~10个柱体积，检测调零后上样；

第二步上样：样品应保持澄清，如发现沉淀浑浊则需要离心，样品中离子强度不宜超过5ms/cm，收集流出；

第三步平衡：上样结束，用平衡液平衡层析柱，直到紫外检测读数回到基线或相对稳定；

第四步洗脱：用不同盐浓度：1）20mM Tris-HCl，pH8.0，50mMNaCl；2）20mM Tris-HCl，pH8.0，100mMNaCl；3）20mM Tris-HCl，pH8.0，200mMNaCl；4）20mM Tris-HCl，pH8.0，300mMNaCl；5）20mM Tris-HCl，pH8.0，500mMNaCl分步洗脱，分步收集各个洗脱组分。