[发明专利]一种用于快速基因克隆的酶混合物及制备方法、包含该酶混合物的试剂盒

说明书

技术领域

本发明涉及分子生物学技术领域，具体地涉及一种酶混合物，尤其涉及一种用于快速基因克隆的酶混合物及其制备方法。此外，本发明还涉及包含该酶混合物的试剂盒。

背景技术

λ噬菌体Red重组系统已成功地应用于基因的定点替代、修复和染色体工程中，特别的，该系统也可应用于快速基因克隆，取代传统的TA克隆法，限制性酶切与连接法等。TA克隆高效、成功率高，但是需要单独再次构建表达载体。限制性酶切与连接法是利用Ⅱ型限制性内切酶双酶切，将目的基因和表达载体切出互补的粘性末端，利用T4 DNA ligase将互补的粘性末端或者平末端连接。这两种方法费时费力并且在克隆设计上经常会遇到很多限制，比如：1.没有合适的酶切位点。2.多余的酶切位点又会增加不必要的氨基酸，在蛋白表达中使重组蛋白与天然蛋白性质变得不同。3.不适合高通量的基因克隆等等。

所以，一种不依赖连接酶，而直接用同源重组的方法，即无缝克隆（seamless cloning）技术，完成目的片段与载体相连接的基因克隆技术日渐获得研究者的青睐。目前，市场上销售的无缝克隆酶或试剂盒有：Invitrogen公司的Seamless Cloning and AssemblyKit；Clontech的In-Fusion^TM HD Cloning Kit；金斯瑞的重组克隆试剂盒；德聚生物的Dogene seamless cloning kit等等。这些试剂盒使用融合酶，重组酶或酶混合物，可以促进有15bp末端序列同源的线性化载体和目的片段的同源重组而完成无缝克隆实验。这些试剂盒都无需酶切连接，但是有的反应时间超过30分钟，如，Seamless Cloning andAssembly Kit和重组克隆试剂盒，有的反应过程复杂，需要两个不同的温度，如重组克隆试剂盒（室温25°C 30分钟，然后冰上放置5分钟），Dogene seamlesscloning kit（室温25℃，30分钟；然后42℃，15分钟）；Clontech的In-Fusion^TM HD CloningKit虽然只要15分钟，但它需要在50℃温度下反应，需要提前预热水浴锅，不如室温25℃放置简单方便，等等这些都给实验带来不便。因此，亟需研发一种新的融合酶，重组酶或酶混合物用于无缝克隆。

发明内容

本发明要解决的技术问题之一在于提供一种用于快速基因克隆的酶混合物，其可有效应用于无缝克隆(seamless cloning)，在室温下放置较短时间就能达到很高的阳性率。

本发明要解决的技术问题之二在于提供  一种包含该酶混合物的试剂盒。

本发明要解决的技术问题之三在于提供一种该酶混合物的制备方法。

为了解决上述技术问题，本发明采用如下技术方案：

在本发明的一方面，提供一种用于快速基因克隆的酶混合物，该酶混合物由Redα蛋白，Redβ蛋白和Gam蛋白组成，在该酶混合物中，三种蛋白的混合比例如下：Redα蛋白的使用浓度为3ng/μl；Redβ蛋白的使用浓度为150ng/μl-1500ng/μl；Gam蛋白的使用浓度为3ng/μl-300ng/μl。

本发明是一种基于λ噬菌体Red重组系统的应用于快速基因克隆技术的酶混合物。研究表明，Red重组系统要发挥其高效的同源重组功能，需要Redα，Redβ和Gam三种蛋白的作用。Redα，Redβ和Gam来源于基因工程重组蛋白，纯度>95%。Redα是一个24kd的蛋白，具有5′→3′核酸外切酶的活性，可使线性双链DNA产生突出的3′粘性末端。Redβ是一种退火蛋白，分子量为25kD，可以自发地形成环状结构，紧紧地结合在单链DNA3′粘性末端，防止DNA被单链核酸酶降解，同时介导互补单链DNA的退火，促进替代基因两端的序列和与其同源的靶基因序列间发生重组，在重组反应中起非常大的作用。Gam蛋白只有16kd，但它能与宿主细胞中RecBCD核酸酶结合，抑制RecBCD核酸酶对外源DNA的降解，对外源DNA起到保护作用。

在本发明的另一方面，提供一种含有上述酶混合物的试剂盒。该试剂盒还包括如下反应缓冲液：100-500mM的Tris-Hcl（pH 7.5，25℃），100mM的MgCl2，10mM的ATP，5-10mM的DTT，0-0.5%mM的BSA。mM=1mmol/L毫摩尔每升。

在本发明的另一方面，提供一种该酶混合物的制备方法，包括如下步骤：