[发明专利]大熊猫西氏贝蛔虫38kDa抗原及其制备方法和应用

权利要求书

1.大熊猫西氏贝蛔虫38kDa抗原，其特征在于，其抗原基因为Bsc38基因，该基因核苷酸序列如表1所示：Bsc38编码成熟肽的核苷酸序列，对应氨基酸序列如表2所示。

2.一种权利要求1所述大熊猫西氏贝蛔虫38kDa抗原的制备方法，其特征在于，大熊猫西氏贝蛔虫38kDa抗原按照以下步骤制备：

2.1 提取大熊猫西氏贝蛔虫虫体总RNA，以该RNA为模板进行反转录，合成第一条cDNA，以合成的cDNA为模板进行Bsc38基因扩增；

上游引物：5'-TAAAGATGGCATTGGCCGCATCG-3'，

下游引物：5'-CACTCTTTGATGAAATGCCATCTGTC A-3'；

2.2 对克隆质粒进行目的片段序列测定；

2.3 根据Bsc38基因所测序列，除去信号肽序列，扩增编码成熟肽核苷酸序列引物：

上游引物：5'-CCCAAGCTTCGACAATCTCGCAGT-3'，含HindIII酶切位点AAGCTT，

下游引物：5'-CCGCTCGAGTCACTCTTTGATGAAATGCCATCTGTC-3'，含XhoI酶切位点CTCGAG；

2.4 PCR扩增产物经琼脂糖凝胶分离纯化后，与表达载体pET32a (+)一起进行HindIII和XhoI双酶切；然后将目的片段与pET32a (+)进行连接，构建表达载体pET32a(+)-Bsc38；重组载体被重新转入克隆菌DH5α进行再次克隆并测序；将测序正确的重组表达质粒转入表达宿主菌BL21（DE3）进行IPTG诱导表达；表达温度选择37℃，诱导时间为5 h；离心收集表达菌株，并重悬于预冷的50 mM NaH₂ PO₄ (pH 8.0)、10 mM Tris-HCl (pH 8.0)、100 mM NaCl裂解液中，按100 mL培养物每5 mL裂解液进行裂解；然后将裂解菌液进行超声处理并离心，收集沉淀，弃去上清；用8 M尿素冲洗所得沉淀直至完全溶解，在含有8 M尿素的变性条件下分离纯化得到重组Bsc38表达蛋白；该重组Bsc38表达蛋白即为所要制备的抗原。

3.根据权利要求2所述的大熊猫西氏贝蛔虫38kDa抗原的制备方法，其特征在于，Bsc38基因扩增和编码成熟肽核苷酸序列扩增的PCR反应体系和反应程序为：

PCR反应体系（25μL）：2 μL cDNA、1.0 U Taq DNA 聚合酶、3.0 mM MgCl₂、400 μM dNTP混合液、50 μM 10× PCR 缓冲液(Mg²⁺ Free)、8μL ddH₂O、上下游引物各10 pmol；

PCR反应程序：94℃预变性5 min；94℃变性30 sec，62℃退火30 sec，72℃延伸45 sec，循环扩增35次，最后72°延伸10 min；扩增产物用2%琼脂糖凝胶电泳进行分离，纯化；然后纯化产物被连接入pMD19-T载体，转感受态细胞DH5α进行亚克隆。

4.根据权利要求1所述的大熊猫西氏贝蛔虫38kDa抗原的应用，其特征在于，将重组Bsc38蛋白用0.01 M, pH 7.4的稀释液PBS稀释，然后与弗氏完全佐剂FCA进行等体积混合制成针剂，混合液4℃避光处理16 h，以备使用。