[发明专利]大熊猫西氏贝蛔虫38kDa抗原及其制备方法和应用

说明书

技术领域

本发明属大熊猫蛔虫病防治研究领域，涉及一种西氏贝蛔虫抗原以及该抗原的制备及其应用。

背景技术

大熊猫作为我国的国宝和野生动物保护的旗舰物种，被公认为全球最为濒危的物种之一，其目前仅分布于青藏高原以东的秦岭、名山、大相岭、小相岭及凉山5个山系，种群数量为2,500-3,000。西氏贝蛔虫(Baylisascaris schroederi)是大熊猫体内最为常见的一种肠道寄生虫，对野生和圈养大熊猫危害极大。西氏贝蛔虫成虫通常寄生于大熊猫的肠道内，但偶尔也可出现于大熊猫的口腔、喉、气管、胃、胰管及胆管内。因其成虫和幼虫所在位置的不同，对大熊猫造成的损害也不同。移行期幼虫可引起广泛而严重内脏幼虫移行症(VLM)如：肠炎、肠损伤以及典型蠕虫性的肝炎和肺炎，而成虫则可导致肠道堵塞、炎症甚至大熊猫的死亡。和所有其它蛔虫类似，西氏贝蛔虫主要是经口感染且整个发育过程无任何中间宿主。感染性虫卵经口摄入，卵中所含的L2期幼虫在小肠内孵出，然后穿过肠壁，移行至肝脏(L3)和肺脏(L4)，最终经咽喉回到肠道发育成熟，交配并产卵，其虫卵随粪便排除。虫卵对各种理化物质和不良环境条件具有较强的抵抗力且在潮湿的土壤里能存活数年之久，因此极易引起大熊猫的感染。在自然条件下，野生大熊猫西氏贝蛔虫的感染率可达50%以上，甚至100%，是引起野生大熊猫死亡的主要原发性和继发性病因之一。从1971年至2005年间因感染西氏贝蛔虫而导致野生大熊猫死亡的现象日趋明显，其中仅2001年至2005年5年时间由VLM造成的死亡数就占到了总死亡数了50%。此外，最新数据显示野生大熊猫西氏贝蛔虫的自然感染率目前仍超过54.0%。

迄今为止，国内外未见任何可用的预防性疫苗，大熊猫西氏贝蛔虫病的防治仍以药物防治为主，且整个防御过程遵从多剂量、轮换用药的原则，直到大熊猫排净虫体或虫卵。然而，快速出现的耐药性虫株以及化学药物所产生的食物链和环境污染，加之自然环境下大熊猫的重复性感染迫使我们不得不寻求新的预防和控制措施。而疫苗免疫似乎是一个理想的防控手段。

先前的研究已经证实，使用紫外线照射的感染性蛔虫幼虫或者虫卵免疫动物可使动物产生较强的免疫力，抵制蛔虫的感染。另外，利用不同发育阶段蛔虫幼虫的粗提抗原也可诱导动物机体产生免疫保护力。可惜这些方法被相应因素所局限，例如：潜在的偶发性感染，如感染性蛔虫幼虫或者虫卵，以及有限数量的蛔虫天然抗原。因此，探求一种安全实际的免疫方法成为了必要，而使用非侵染性且可大量制备的重组疫苗抗原不失为一个更好的选择。最近，几个猪蛔虫重组大肠杆菌蛋白抗原已被证实能够给予实验小鼠免疫保护力从而抵御猪蛔虫感染性虫卵的攻击。类似的现象(西氏贝蛔虫大肠杆菌重组抗原)也被观察存在于西氏贝蛔虫——小鼠感染模型。然而截至目前，可用作西氏贝蛔虫特异的疫苗靶向性蛋白抗原数量仍很缺少；重要的是这其中所涉及的准确免疫机制仍有待进一步确定，尽管先前发表的研究成果已表明多数胃肠道寄生性线虫感染以诱导宿主产生较强的Th2性免疫反应为主。

发明内容

鉴于此，本发明的目的在于提供一种针对西氏贝蛔虫病的安全有效的能够激发大熊猫抗西氏贝蛔虫病的抗原，以及制备该抗原的方法和该抗原的应用。

为解决上述技术问题，本发明提供的技术方案是，提供一种大熊猫西氏贝蛔虫38kDa抗原，该抗原基因为Bsc38基因，该基因核苷酸序列如表1所示，对应氨基酸序列如表2所示。

本发明还提供了上述大熊猫西氏贝蛔虫38kDa抗原的制备方法，按照以下步骤进行：

2.1提取大熊猫西氏贝蛔虫虫体总RNA，以该RNA为模板进行反转录，合成第一条cDNA，以合成的cDNA为模板进行Bsc38基因扩增；

上游引物：5'-TAAAGATGGCATTGGCCGCATCG-3'，

下游引物：5'-CACTCTTTGATGAAATGCCATCTGTC A-3'；

2.2对克隆质粒进行目的片段序列测定；

2.3根据Bsc38基因所测序列，除去信号肽序列，扩增编码成熟肽核苷酸序列引物：

上游引物：5'-CCCAAGCTTCGACAATCTCGCAGT-3'，含HindIII酶切位点AAGCTT，

下游引物：5'-CCGCTCGAGTCACTCTTTGATGAAATGCCATCTGTC-3'，含XhoI酶切位点CTCGAG；