[发明专利]一种采用篮式反应器发酵制备猪圆环病毒的方法

权利要求书

1.一种采用篮式反应器发酵制备猪圆环病毒的方法，其特征在于，包括以下步骤：

(1) 宿主细胞种的制备

采用常规细胞培养方法培养宿主细胞；

(2) 篮式反应器接种前的准备

在篮式反应器的载体篮内装入篮式反应器专用的Fibra Disk载体，加入PBS溶液，使载体能够全部浸泡在该PBS溶液液中，做灭菌处理；

(3) 宿主细胞扩大培养

在向所述反应器内接种步骤(1)所得宿主细胞前，排出反应器内的PBS溶液，加入细胞生长液，先按宿主细胞扩大培养的条件设定好篮式反应器的各项参数，包括温度、溶解氧(DO)、PH和搅拌速率，直到各参数稳定后，再将步骤(1)所得宿主细胞接种至篮式反应器内，让宿主细胞在浸泡于细胞生长液中的Fibra Disk载体上吸附生长，当培养至细胞耗糖量稳定时，接种病毒；

(4) 病毒增殖培养

将所述反应器内的细胞生长液排空，补充与排出的细胞生长液等体积的细胞维持液后，接种猪圆环病毒，接毒后36~48h，进行第一次收取病毒液，在收获病毒液后，再向反应器内加入与已收取的病毒液等体积的细胞维持液，对病毒再次进行繁殖复制并收获，如此循环反复多次，直至检测到要收获的病毒液中的细胞耗糖量降至0.5g/L/天以下时，收获本批次最后一次猪圆环病毒液。

2.根据权利要求1所述的采用篮式反应器发酵制备猪圆环病毒的方法，其特征在于，所述步骤(4)中自第一次收取猪圆环病毒液起，每间隔8~12小时收取一次猪圆环病毒液。

3.根据权利要求1或2所述的采用篮式反应器发酵制备猪圆环病毒的方法，其特征在于，所述步骤(4)的细胞维持液由RPMI-1640培养基液和牛血清组成，其中，RPMI-1640培养基液的体积分数为98%~99.5%，牛血清的体积分数为0.5%~2%。

4.根据权利要求3所述的采用篮式反应器发酵制备猪圆环病毒的方法，其特征在于，所述步骤(4)的病毒增殖培养的条件：PH：7.2~7.5，溶解氧：50%~80%，搅拌桨转速：60~90 RPM，温度：33℃~37℃。

5.根据权利要求4所述的采用篮式反应器发酵制备猪圆环病毒的方法，其特征在于，所述步骤(3)的宿主细胞按照每克载体接种1~5×10⁶cells的密度接种于篮式反应器内，所述篮式反应器中每1L的有效体积中装填25~40g载体，而加入的细胞生长液没过篮式反应器中的搅拌桨的桨叶。

6.根据权利要求5所述的采用篮式反应器发酵制备猪圆环病毒的方法，其特征在于，所述步骤(3)中宿主细胞在篮式反应器内培养5~7天，细胞耗糖量稳定在1~1.5g/L/天或1.5g/L/天以上，此时的宿主细胞应用于病毒培养。

7.根据权利要求6所述的采用篮式反应器发酵制备猪圆环病毒的方法，其特征在于，所述步骤(3)中，定时取反应器中的培养液样品，测定细胞耗糖量，当连续几次测定的细胞耗糖量的数值都趋于接近时，确定细胞耗糖量已稳定。

8.根据权利要求7所述的采用篮式反应器发酵制备猪圆环病毒的方法，其特征在于，所述步骤(3)中的细胞生长液由RPMI-1640培养基液和牛血清组成，其中，RPMI-1640培养基液93%~97%，牛血清3%~7%；所述宿主细胞扩大培养的条件为：PH：7.0~7.3，溶解氧：50%~80%，搅拌桨转速：50~100 RPM，温度：37℃；所述的消毒灭菌处理的具体操作为：在120~125℃的温度下灭菌30~50min。

9.根据权利要求8所述的采用篮式反应器发酵制备猪圆环病毒的方法，其特征在于，所述步骤(3)所述的宿主细胞采用灌注培养方式进行扩大培养。

10.根据权利要求9所述的采用篮式反应器发酵制备猪圆环病毒的方法，其特征在于，所述的宿主细胞为PK-15细胞。