[发明专利]一种采用篮式反应器发酵制备猪圆环病毒的方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种猪圆环病毒大规模扩增的生产方法，尤其涉及一种采用篮式反应器发酵制备猪圆环病毒的方法。

背景技术

猪圆环病毒(Porcine circovirus，PCV)按照血清型可分为猪圆环病毒Ⅰ型(简称PCV1)和猪圆环病毒Ⅱ型(简称PCV2)两种，其中PCV1不具致病性，但能产生血清抗体，PCV2则能对猪只具有较强的易感性，是引起断奶仔猪多系统衰竭综合征(PMWS)、猪呼吸疾病综合征(PRDC)、猪皮肤和肾病综合征(PDNS) 等多种疾病的主要病原，PCV有7个开放阅读框(ORF)，其中ORF2编码病毒的Cap蛋白，构成病毒的核衣壳。PCV1和PCV2的Cap蛋白上存在共同的抗原决定簇，但两者之间没有抗原交叉性，所以通常采用致病性PCV2的ORF2替代PCV1的ORF2，构建嵌合型猪圆环病毒PCV1-2，用于防治断奶仔猪多系统衰竭综合症。然而PCV是一种DNA病毒，病毒变异率低，生物学特性比较特殊，它在细胞上增殖滴度很低，且不引起细胞病变，在研制灭活疫苗和弱毒疫苗的难度很大。

目前，国内的猪圆环病毒疫苗大部分依靠传统的转瓶培养法工艺生产，少量依靠微载体悬浮培养工艺生产。其中，传统的转瓶培养法是将细胞种从液氮罐中取出来，用培养瓶复苏，待细胞长满培养瓶后，用胰蛋白酶消化细胞，分传成几个培养瓶，依次类推，待培养瓶数量够多时，用胰蛋白酶消化，将消化好的细胞转移到转瓶中生长。细胞在转瓶上长满后，再用胰蛋白酶消化，分传成几个转瓶，这些转瓶可以再传代为多个转瓶，或者接种病毒，接毒后的转瓶经过一段时间后收获病毒。为了提高病毒侵染效率，在接种病毒的同时会添加主要成分为氨基葡萄糖的孵育剂，促进病毒对细胞的侵染，以缩短病毒培养时间。这种工艺过程简单，可以通过不断地细胞传代，可规模性地复制放大，但是需要不断地分传，操作繁琐，生产劳动强度大，效率低。而使用的培养瓶和转瓶多，占地多，耗能大，在分传时易污染，病毒毒价低，生产的疫苗不同批次间差异明显，所获得的病毒液中细胞碎片、蛋白等杂质较多，后期处理工艺复杂，容易导致疫苗质量稳定性差。

微载体悬浮培养工艺是近年来新兴的细胞生产方式，是在培养容器的培养液中加入对细胞无害的微载体，使细胞在微载体表面附着生长，同时在培养过程中通过持续搅动使微载体始终保持悬浮状态，使细胞能够与之充分接触。虽然与传统的转瓶培养法工艺相比，占地少，耗能小，用人少，生产规模更容易扩大，病毒毒价较高，产品质量稳定等优点，但是其生产工艺存在以下问题：① 存在细胞与微载体的接触概率和相融性问题，细胞种接种不易均匀；② 病毒接种时需排空细胞生长液，在换液时会损失微载体；③ 微载体颗粒小，难以将其孔隙内的细胞碎片等杂质清洗干净，因此不能回收利用，只能一次性使用，而微载体价格昂贵，造成生产成本高；④ 细胞在微载体上的生长状态为伸展形态，接近平面结构，接种病毒后，细胞死亡过程是同步的，即绝大多数的细胞死亡时间接近，而且为了提高病毒侵染效率，在细胞培养液中需要添加主要成分为氨基葡萄糖的孵育剂，促进病毒对细胞的侵染，因此仅能一次性收获病毒。例如40L反应器应用微载体悬浮培养工艺只能收获30到40L的病毒液，没有达到反应器灌注工艺的最大生产效率，收获的病毒液体积少，致使生产成本较高。

在转瓶培养工艺和微载体悬浮培养工艺中，在宿主细胞培养好后，需要用无菌PBS溶液清洗宿主细胞1至2遍，排出PBS溶液后再补加细胞维持液。其目的是清除残余血清、细胞碎片、蛋白等杂质，但是这一过程对于宿主细胞有损害作用，并会残留少量PBS溶液，由于该溶液只有清洗作用，非宿主细胞生长代谢的必须物，它的存在会影响细胞维持液的浓度，直接影响到细胞生产病毒的效率。