[发明专利]单核细胞增生李斯特氏菌核酸标准样品、其建立方法及应用

权利要求书

1.一种单核细胞增生李斯特氏菌（Listeria monocytogenes）标准样品，其特征在于：制备方法的具体步骤如下：

Ⅰ.基因组核酸的提取

①单核细胞增生李斯特氏菌（Listeria monocytogenes）ATCC：7644，经菌株活化、增菌培养；

②将步骤①获得的增菌培养液于4000g，4℃离心15min；

③吸弃上清，取沉淀1~3mL，加pH8.0的TE溶液10mL悬浮，加0.5mL浓度为100g/L SDS和50μL浓度为20mg/mL的蛋白酶K，混匀，37℃温浴1h；

④加2mL浓度为5mol/LNaCl，混匀，加1.5mLCTAB-NaCl混合溶液，混匀，65℃温浴20min；其中，CTAB-NaCl混合溶液为100g/L CTAB和0.7mol/L NaCl；

⑤取上清，加与上清等体积的酚-氯仿-异戊醇混合液，混匀，6000g离心10min；其中，酚-氯仿-异戊醇混合液中酚∶氯仿∶异戊醇的体积比为25∶24∶1；

⑥取上清，加与上清等体积的氯仿-异戊醇混合液，混匀，6000g离心10min；其中，氯仿-异戊醇混合液中氯仿∶异戊醇的体积比为24∶1；

⑦取上清，加上清0.6倍体积的异丙醇，混匀，13000g离心10min；

⑧取沉淀，用70%乙醇清洗2次，干燥，加4mL pH8.0的TE溶液溶解，获得单核细胞增生李斯特氏菌（Listeria monocytogenes）ATCC：7644基因组核酸溶液；

⑨紫外分光光度计测步骤⑧所得产物的260nm和280nm处的光密度值，当OD₂₆₀/OD₂₈₀比值在1.7～1.9之间时，分装核酸样品并进行冷冻干燥；

Ⅱ.冷冻干燥

①样品预冻：先把步骤Ⅰ所得的核酸样品在-80℃低温冷冻2h；

②冷冻过程：置干燥室制冷，温度降至-35℃时开启冷却阱制冷；冷却阱制冷温度降至-40℃时，将预冻的核酸样品迅速放入干燥室内，关好干燥室门；启动真空泵开始抽真空；待真空度降至0.5Torr时，结束冷冻过程；

③样品干燥：干燥室温度设置为15℃，当真空度降至0.1Torr时，关闭真空泵，取出样品，迅速旋紧瓶盖获得单核细胞增生李斯特氏菌（Listeria monocytogenes）ATCC：7644基因组核酸标准样品，置于-20℃中避光贮存。

2.一种用于非疾病诊断目的的单核细胞增生李斯特氏菌的Real-Time PCR检测试剂盒，其特征在于，包括单核细胞增生李斯特氏菌（Listeria monocytogenes）检测基因和阳性标准对照品，

Ⅰ.单核细胞增生李斯特氏菌（Listeria monocytogenes）的检测基因，包括：

单核细胞增生李斯特氏菌（Listeria monocytogenes）的prfA基因PCR引物：

正向引物    SEQ ID NO：1

反向引物    SEQ ID NO：2

单核细胞增生李斯特氏菌（Listeria monocytogenes）特异性实时PCR引物和探针：

正向引物    SEQ ID NO：3

反向引物    SEQ ID NO：4

探针        SEQ ID NO：5

Ⅱ.所述的阳性标准对照品是权利要求1所述的单核细胞增生李斯特氏菌（Listeria monocytogenes）ATCC：7644的标准样品。