[发明专利]单核细胞增生李斯特氏菌核酸标准样品、其建立方法及应用

说明书

技术领域

本发明属于食品检测技术领域，具体涉及单核细胞增生李斯特氏菌核酸标准样品制备、其建立方法及其在检测单核细胞增生李斯特氏菌中的应用。

背景技术

食品安全是重大公共卫生问题，是制约我国经济发展的重要因素。而微生物污染造成的食源性疾病，是我国食品安全中最突出的问题。近年来，随着食品产业结构的调整、经济全球化与国际贸易的迅速发展，我国食源性疾病的防控面临一系列新问题和挑战。

食品中微生物引起食源性疾病的预防与控制已引起了世界各国关注，食品中微生物的检测技术是预防与控制的关健的技术环节。目前我国食品中微生物的检测仍以传统的病原菌培养、血清抗体检测、和生化特征比较水平为主，不能满足日益发展的检验检疫工作的需要。常规分离培养耗时长，灵敏度低，某些微生物的培养极为困难。随着2007年《食品中致病菌检测方法——实时PCR法》（SN/T1870-2007）和《食品中多种致病菌快速检测方法——PCR法》（SN/T1869-2007）两项检验检疫行业标准的发布实施，以及即将发布实施的《食品中致病菌检测方法——DHPLC法》等系列分子生物学检测国家标准和行业标准。简单快速，灵敏度高的PCR、实时荧光PCR技术，正在食品致病菌检测领域开始发挥重要作用。

由于食品中细菌的特殊性，人们很难获得细菌分子生物学检测阳性样品，加之食品中致病菌分子生物学检测技术的研究刚刚起步，而配套的标准样品的研究工作则起步较晚，制备技术复杂，样品定值和不确定度的评估存在很多困难，因而国内外食品致病菌核酸标准样品（定量、定性测试）基本上是一片空白。目前国内外没有适用于食品中致病菌分子生物学检测用核酸标准样品，仅有成套分子生物学检测试剂盒中配备的阳性对照品，价格非常昂贵，也不具备核酸标准样品的效能，不能适时地满足检验检疫工作的需要。研究制备新型的食品致病菌核酸标准样品，对于保证灵敏、特异、快速检测食品中致病菌，具有十分重要的意义。

为了解决食品中致病菌核酸标准样品目前国内外均处于空白状况，本项目主要针对食品中致病菌核酸定性和定量检测项目，研究制备食品中单核细胞增生李斯特氏菌（Listeria monocytogenes）核酸标准样品。通过对致病菌核酸标准样品的关键制备技术和保存技术的研究，并进行定值技术和定值方式的研究，开展均匀性和稳定性研究，并对食品中致病菌核酸标准样品的不确定度进行深入细致的研究，最终研制出具有较好的均匀性和稳定性的单核细胞增生李斯特氏菌（Listeria monocytogenes）核酸标准样品。开发处于世界领先水平，具有我国自主知识产权的食品中致病菌核酸标准样品制备技术；满足食品安全检测的需求，满足国内外食品微生物检测实验室的需求。

发明内容

鉴于食品中致病菌单核细胞增生李斯特氏菌核酸标准样品紧缺的状况，根据实际工作的需要和国内现状开展了食品中致病菌核酸标准样品的研制。本项标准样品的制备完成，对全面深入的研究解决食品中致病菌核酸标准样品的制备技术和稳定性保证技术，积极开展我国食品中致病菌分子生物学检测标准样品的研制，添补该测量领域的空白，具有很重要的现实意义。加之人们对食品安全方面的关注和重视，以及开展食品中致病菌分子生物学检测工作的日益扩展和重要性，标准样品又是实验室质量控制工作的重要环节，食品致病菌核酸标准样品具有广阔的市场，有较大的经济效益和社会效益。

本发明所采用的技术方案是：单核细胞增生李斯特氏菌（Listeria monocytogenes）ATCC：7644的菌株培养、鉴定、核酸标准样品的制备、核酸标准样品的干燥、均匀性和稳定性检查、定性检定、核酸标准样品定值等项工作。取制备的核酸标准样品，经采用实时PCR方法和PCR方法定性分析，确认所制备的核酸标准样品为单核细胞增生李斯特氏菌（Listeria monocytogenes）ATCC：7644核酸样品。采用PicoGreen DNA分子荧光定量方法及紫外分光光度法，随机抽取样品进行测试，数据进行T检验和F检验确认样品均匀性。经Grubbs检验和Cochran检验，所有数据均可作为定值依据；经正态性检验，这些数据符合正态分布。制备的核酸样品经过了四年的稳定性测定，在避光、密封，-20℃以下温度贮存，四年内稳定。

本发明的一方面在于：一种单核细胞增生李斯特氏菌（Listeria monocytogenes）标准样品，其特征在于：制备方法的具体步骤如下：

（一）基因组核酸的提取

①单核细胞增生李斯特氏菌（Listeria monocytogenes）ATCC：7644经菌株活化、增菌培养；