[发明专利]一种低聚半乳糖的制备方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种低聚半乳糖的制备方法，特别是一种利用固定化酶生产低聚半乳糖的方法。

背景技术

低聚半乳糖（galacto-oligosaccharide，GOS）是一类天然存在于动物母乳中的功能性低聚糖，具有出色的保水力和极强的酸热稳定性，不能被人小肠消化吸收，但可被结肠菌群发酵，能促进双歧杆菌增殖，抑制有害病原菌和腐败菌生长，促进钙、镁、钾的吸收，有利于B族维生素、烟酸和叶酸的生成，能有效刺激肠道蠕动，减少和防止便秘的发生，降低结肠中有毒物质的含量等调节肠道微生态、促进肠道健康的作用。

低聚半乳糖是以乳糖为原料经β-半乳糖苷酶（EC3.2.1.23）催化制得，是在乳糖分子中的低聚半乳糖基上以β（1→2）键或β（1→3）、β（1→4）键、β（1→6）键连接1～4个半乳糖分子的寡糖类混合物。

目前通常使用游离细胞或游离β-半乳糖苷酶酶来生产低聚半乳糖。在生产过程中，产品会引入游离细胞或蛋白质等杂质，需要增加复杂的提纯工艺，不利于清洁生产。为了解决此问题，已研究出将细胞进行固定化，并利用固定化的细胞生产低聚半乳糖的方法。该方法能简化生产工艺，含β-半乳糖苷酶的固定化细胞可以重复利用，节省了生产成本。固定化细胞常采用海藻酸钙包埋法，在利用固定化细胞转化乳糖的过程中，由于温度较高且海藻酸钙机械强度差，导致固定化细胞容易破碎，从而引入糖浆中，造成糖浆在后续过滤工序中容易堵塞过滤装置，使过滤压力升高较快。

另外，目前用于生产β-半乳糖苷酶的菌种有脆壁克鲁维酵母（Kluyveromyces fragilis)、黑曲霉（Aspergillus niger)、米曲霉（Aspergillus oryzae)、乳酸克鲁维酵母（Kluyveromyces lactis）等微生物。其中，脆壁克鲁维酵母所产的β-半乳糖苷酶为胞内酶，乳酸酵母、黑曲霉、米曲霉、米根霉等所产的β-半乳糖苷酶为胞外酶。胞内β-半乳糖苷酶的获取需要进行破碎菌体、分离提纯等步骤，这增加了生产环节和生产设备，同时耗能也增加。若菌株直接将β-半乳糖苷酶分泌到胞外，则大大方便了酶的分离和利用，并且节省生产成本。已知环状芽孢杆菌所产的β-半乳糖苷酶为胞外酶，并具有耐高温的性质，但是利用环状芽孢杆菌生产β-半乳糖苷酶的报道很少。

发明内容

本发明的一个目的在于提供一种低聚半乳糖的制备方法，利用该方法能够获得较高的低聚半乳糖得率。

本发明的另一个目的在于提供一种固定化β-半乳糖苷酶的制备方法，利用该方法制备的固定化酶具有机械强度高、物化性能稳定等优点，能够有效解决采用海藻酸钙包埋法制备的固定化细胞或固定化酶生产低聚半乳糖的过滤工序中过滤压力上升较快的问题。

本发明的又一个目的在于提供一种利用环状芽孢杆菌（Bacillus circulans）生产β-半乳糖苷酶的方法，该方法能够显著提高β-半乳糖苷酶的产量。

本发明所采用的技术方案是：

一种低聚半乳糖的制备方法，包括以下步骤：

（1）使用戊二醛在15-35℃下与大孔弱碱苯乙烯树脂在搅拌下反应16-24h，使树脂活化；

（2）取液体β-半乳糖苷酶与步骤（1）所得的活化的大孔弱碱苯乙烯树脂在15-35℃下搅拌反应16-24h，得到固定化的β-半乳糖苷酶；

（3）将固定化的β-半乳糖苷酶加入乳糖溶液中，于48-52℃搅拌反应24-36h。

优选地，步骤（2）所述的β-半乳糖苷酶在使用前经盐析进行提纯。

优选地，步骤（2）中β-半乳糖苷酶与大孔弱碱苯乙烯树脂的配比为100-200U/g树脂；步骤（3）中所加入的乳糖浓度为45%-52%（w/w），并按照每千克乳糖（按干基计）加入6000-10000U的固定化β-半乳糖苷酶。

优选地，步骤（2）中所述β-半乳糖苷酶由环状芽孢杆菌产生。

优选地，步骤（2）中所述β-半乳糖苷酶经以下步骤制备：

A.将保存的环状芽孢杆菌接种至LB固体培养基，于36-38℃下培养16-24h，使菌种活化；

B.取活化的菌种接种至20-50ml的LB液体培养基中，振荡培养46h后接种至装有LB培养基的种子罐中，于36-38℃下培养4-6h，得到种子培养液；

C.将种子培养液接入装有发酵培养基的发酵罐中培养36-48h，得到环状芽孢杆菌发酵液；

D.将发酵液经微滤或离心除去菌体，再将所得酶液浓缩，得到液体β-半乳糖苷酶。