[发明专利]β-1，4-内切木聚糖酶工程菌的构建及其酶的应用

权利要求书

1.一种β-1，4-内切木聚糖酶工程菌，其特征在于：其核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示，命名为木聚糖酶基因Cb Xyn10C。

2.如权利要求1所述的β-1，4-内切木聚糖酶工程菌，其特征在于：所述木聚糖酶基因Cb Xyn10C来源于热解纤维素菌(Caldicellulosiruptor bescii DSM 6725)。

3.如权利要求1所述的一种β-1，4-内切木聚糖酶工程菌的构建方法，其特征在于，包括以下步骤：

A、基因组DNA的提取

取5ml小试管培养的Caldicellulosiruptor bescii DSM 6725，用细菌基因组DNA小量提取试剂盒提取细菌的基因组，得到基因组DNA溶液；

B、引物设计及用PCR法提取木聚糖酶目的基因

引物设计如下：

上游引物：：5′GGGTCGCGGATCCATAGAAACTACTAAAAC 3′，划线部分为BamH I的酶切位点；

下游引物：5′GGTGGTGCTCGAGTTATTCTTCTGGCACAACTG 3′，划线部分为Xho I的酶切位点；

以步骤A所得基因组DNA溶液为模板，在上述上游引物和下游引物的参与下进行PCR反应，得到扩增产物，再对扩增产物用扩增产物纯化试剂盒进行纯化，得到纯化的PCR产物，然后用限制性内切酶BamH I和Xho I进行双酶切，37℃下保温2小时，然后用0.8％的琼脂糖凝胶进行电泳，再用DNA凝胶检测试剂盒回收酶切后的目的基因片段，得到Cb Xyn10C，其核苷酸序列如SEQ ID No.1所示；

C、构建重组表达载体

以pET28a为载体，对载体用限制性内切酶BamH I和Xho I进行双酶切，37℃下保温2小时，再用磷酸酶(FastAP)处理去磷酸化，反应20分钟，用0.8％的琼脂糖凝胶进行电泳检测，用胶回收试剂盒回收线性载体片段；

然后将目的基因片段与线性载体片段利用T4DNA连接酶连接，得到重组表达载体；

D、将重组表达载体转化到宿主细胞中

将步骤C所得重组表达载体转入大肠杆菌BL21(DE3)Codon Plus中，用含50μg/ml卡那霉素的LB固体培养基进行阳性克隆筛选，得到含有目的基因的大肠杆菌工程菌。

4.如权利要求3所述的β-1，4-内切木聚糖酶工程菌的构建方法，其特征在于：所述的PCR反应的反应体系按以下方法配制：DNA聚合酶(Primer star)1μl，DNA聚合酶缓冲液(Primer star buffer)20μl，作为模板的基因组DNA溶液2μl，2.5mM脱氧核苷酸混合物(dNTP)8μl，上下游引物各加40pmol，加超纯水至总体积100μl；所述的PCR反应的反应程序为：95℃预变性3min；然后95℃变性30s，57℃退火10s，72℃延伸120s，再72℃延伸15min，共30个循环。

5.如权利要求3所述的β-1，4-内切木聚糖酶工程菌的构建方法，其特征在于：步骤C所述的用限制性内切酶BamH I和Xho I进行双酶切的酶切体系包括：pET28a空载体45μl，上下游引物各2μl，FD-buffer 7μl，加ddH₂O 14μl至总体积70μl。

6.如权利要求3所述的β-1，4-内切木聚糖酶工程菌的构建方法，其特征在于：所述的脱氧核苷酸混合物是脱氧腺嘌呤苷酸、脱氧鸟嘌呤苷酸、脱氧胞嘧啶核苷酸和脱氧胸腺嘧啶核苷酸的混合物，每种核苷酸的浓度均为25nmol/L。

7.一种用权利要求1或3所述的β-1，4-内切木聚糖酶工程菌制备的嗜热木聚糖酶，其特征在于：所述的嗜热木聚糖酶的氨基酸序列如SEQ ID No.2所示，该嗜热内切木聚糖酶的最适反应温度为68℃，最适pH为6.7。

8.一种如权利要求7所述的嗜热木聚糖酶的制备方法，其特征在于：将含有目的基因的大肠杆菌工程菌进行放大培养，然后通过超声破碎、对杂蛋白热失活，并通过进一步的分离纯化，即得到嗜热木聚糖酶。

9.一种如权利要求7所述的嗜热木聚糖酶的应用，其特征在于：所述的嗜热木聚糖酶用于造纸、食品、饲料、纺织和能源的生产领域中。