[发明专利]β-1，4-内切木聚糖酶工程菌的构建及其酶的应用

说明书

技术领域

本发明涉及生物技术，具体涉及一种β-1，4-内切木聚糖酶工程菌的构建、利用该工程菌制备的嗜热木聚糖酶及该酶在工业中的应用。

背景技术

木聚糖酶是可将木聚糖降解成低聚木糖和木糖的一类酶的总称。它是一种多聚五碳糖，是植物半纤维素的重要组分，它占植物碳水化合物总量的三分之一，在自然界中是继纤维素之后含量第二丰富的可再生生物资源。木聚糖酶是可将木聚糖降解成低聚木糖和木糖的一类酶的总称。它可以将木聚糖降解为寡聚木糖、木糖和少量单糖。它在饲料、造纸、食品、制药以及能源工业中均有着广泛的应用。

β-1，4-内切木聚糖酶能够专一降解木聚糖为低聚木糖和木糖，主要从主链内部作用于木糖苷键。其作用方式是在不同位点上作用于木聚糖和长链木寡糖，从β-1，4-D-木聚糖主链的内部切割木糖苷键，从而使木聚糖降解为木寡糖。其水解产物主要为木二糖与木二糖以上的低聚木糖，也有少量的木糖、阿拉伯糖和甘露糖微生物中木聚糖酶。根据木聚糖酶催化区域的结构和性质分析，可将其分为不同的家族，其中糖苷水解酶以第10家族和第11家族居多。由于来源菌株不同而导致其理化性质和分子量不尽相同，其分子量分布在7.7-150kDa，最适pH值分布在2-11。在过去20年中，有大量的木聚糖酶被分离纯化出来，它们的基因已经被克隆，并在大肠杆菌、酿酒酵母、毕赤酵母等系统中进行了表达。当前，木聚糖酶的应用领域不断扩大，它在造纸、食品、饲料、纺织、酿酒、医药、环境和能源等工业都有应用。但能够应用于工业生产的天然木聚糖酶却很少，工业用酶要求有较高的酶活性，良好的pH稳定性及热稳定性。到目前为止，国内有关木聚糖酶产生菌的报道较多，其中以真菌的研究居多，而细菌类研究偏少。

Caldicellulosiruptor bescii DSM 6725是实验室购买的一株木聚糖酶产生菌株，可以在70-75℃的条件下生长，我们由此推断它所产生的木聚糖酶具有良好的热稳定性，具备应用于工业生产的潜力。我们应用转基因技术，将嗜热菌中的相关基因转接到更易培养的大肠杆菌中以高效表达。

发明内容

本发明的目的之一是提供一种能应用于工业的嗜热内切木聚糖酶；

本发明的目的之二是提供编码上述嗜热木聚糖酶的基因；

本发明的目的之三是提供包含上述嗜热木聚糖酶基因的重组菌株；

本发明的目的之四是提供一种制备上述嗜热木聚糖酶的基因工程菌的构建方法；

本发明的目的之五是提供上述嗜热木聚糖酶的应用。

本发明中的内切木聚糖酶工程菌已于2011年12月15日保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，简称CGMCC，地址：中国北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所。保藏编号为CGMCC No.5596。其分类命名为：大肠埃希氏菌，拉丁名：Escherichia coli。

为了实现上述目的，本发明采用了以下技术方案：一种β-1，4-内切木聚糖酶工程菌，其核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示，命名为木聚糖酶基因Cb Xyn10C。

所述木聚糖酶基因Cb Xyn10C来源于热解纤维素菌（Caldicellulosiruptor besciiDSM 6725）。

上述β-1，4-内切木聚糖酶工程菌的构建方法，包括以下步骤：

Ａ、基因组DNA的提取

取5ml小试管培养的Caldicellulosiruptor bescii DSM 6725，用细菌基因组DNA小量提取试剂盒提取细菌的基因组，得到基因组DNA溶液；

Ｂ、引物设计及用PCR法提取木聚糖酶目的基因

引物设计如下：

上游引物：5′GGGTCGCGGATCCATAGAAACTACTAAAAC 3′，划线部分为BamH Ⅰ的酶切位点；

下游引物：5′GGTGGTGCTCGAGTTATTCTTCTGGCACAACTG 3′，划线部分为Xho Ⅰ的酶切位点；

以步骤Ａ所得基因组DNA溶液为模板，在上述上游引物和下游引物的参与下进行PCR反应，得到扩增产物，再对扩增产物用扩增产物纯化试剂盒进行纯化，得到纯化的PCR产物，然后用限制性内切酶BamHⅠ和XhoⅠ进行双酶切，37℃下保温2小时，然后用0.8%的琼脂糖凝胶进行电泳，再用DNA凝胶检测试剂盒回收酶切后的目的基因片段，得到Cb Xyn10C，其核苷酸序列如SEQ ID No.1所示；