[发明专利]高效利用碳源生产生物塑料PHBV的极端嗜盐古菌工程菌

权利要求书

1.极端嗜盐古菌胞外多糖合成相关的基因簇，其编码的蛋白质为如下1）-4）所述的蛋白：

1）由序列表中序列2所示的氨基酸残基序列组成的蛋白质，或者将序列表中序列2的氨基酸残基序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有与序列2所示的蛋白相同活性的蛋白质

和，2）由序列表中序列3所示的氨基酸残基序列组成的蛋白质，或者将序列表中序列3的氨基酸残基序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有与序列3所示的蛋白相同活性的蛋白质；

和，3）由序列表中序列4所示的氨基酸残基序列组成的蛋白质，或者将序列表中序列4的氨基酸残基序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有与序列4所示的蛋白相同活性的蛋白质；

和，4）由序列表中序列5所示的氨基酸残基序列组成的蛋白质，或者将序列表中序列5的氨基酸残基序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有与序列5所示的蛋白相同活性的蛋白质。

2.根据权利要求1所述的基因簇，其特征在于：所述基因簇的序列为下述脱氧核苷酸之一：

1）序列表中序列1所示的自5′末端第547-5762位核苷酸序列；

2）序列表中序列1所示的DNA序列；

3）在严格条件下可与序列表中序列1限定的DNA序列杂交的核苷酸序列。

4）与1）、2）或3）限定的DNA序列具有90％以上同源性，且编码相同功能蛋白质的DNA序列。

3.扩增权利要求1或2所述基因簇的引物对。

4.一种重组极端嗜盐古菌，是将其出发极端嗜盐古菌的基因组中的如权利要求1或2所述的基因簇表达的至少一种蛋白的功能缺失，获得的胞外多糖合成功能缺失的工程菌。

5.根据权利要求4所述的重组嗜盐古菌，其特征在于：所述出发极端嗜盐古菌为地中海富盐菌Haloferax mediterranei；优选为地中海富盐菌Haloferax mediterranei CGMCC1.2087。

6.根据权利要求5所述的重组嗜盐古菌，其特征在于：所述将出发极端嗜盐古菌的基因组中的权利要求1或2所述的基因簇表达的至少一种蛋白的功能缺失的方法是将所述基因簇中编码所述蛋白的基因突变、或/和基因敲除、和/或基因沉默、RNA干扰其表达转录；优选将权利要求1或2所述的基因簇突变、或/和基因敲除、和/或基因沉默、和/或RNA干扰基因簇中编码所述蛋白的基因表达转录。

7.根据权利要求6所述的重组嗜盐古菌，其特征在于：所述基因敲除是通过同源重组实现的；所述同源重组所用的上游交换臂的序列为自序列表中序列1的5′端第1-865位核苷酸序列；所述同源重组所用的下游交换臂的序列为自序列表中序列1的5′端第5763-6282位核苷酸序列；

和/或，所述出发极端嗜盐古菌在基因敲除所述基因簇前，先敲除其基因组中序列如序列表中序列6的5′端第810-1607位核苷酸序列片段获得尿嘧啶合成缺陷型菌株，再以所述尿嘧啶缺陷型菌株作为出发菌株进行所述基因簇的敲除，获得尿嘧啶合成缺陷的胞外多糖合成缺陷型菌株，最后，将序列表中序列6的5′端第810-1607位核苷酸序列片段原位敲回，获得尿嘧啶合成功能与所述出发极端嗜盐古菌相同的胞外多糖合成功能缺失的工程菌。

8.权利要求1-7中任意一项所述的重组极端嗜盐古菌在生产聚羟基脂肪酸酯中的应用。

9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于：所述在生产聚羟基脂肪酸酯的方法，是发酵权利要求1-7中任意一项所述的重组极端嗜盐古菌，得到含有聚羟基脂肪酸酯的菌体细胞；所述发酵在发酵罐中进行，温度32-45℃，通气量1∶1-2:1vvm，搅拌随溶氧的变化手动调节，pH维持在6.5-7.5，罐体内压为1个大气压；所述发酵温度为优选为37℃。

10.根据权利要求8所述的应用，其特征在于：所述发酵用培养基的组分为氯化钠110-220克/升，氯化镁0-10克/升，硫酸镁2-20克/升，氯化钾1-5克/升，氯化钙0-1克/升，碳酸氢钠0-0.3克/升，溴化钠0-0.5克/升，酵母提取物0-10克/升，氯化铵1-5克/升，磷酸二氢钾0.02-4克/升，淀粉10-50克/升，柠檬酸铁铵0.005-0.01克/升，微量元素溶液SL-6 0.5-2毫升/升；pH值为6.5-7.5；所述发酵用培养基的组分优选为氯化钠110克/升，氯化镁9.6克/升，硫酸镁14.4克/升，氯化钾5克/升，氯化钙1克/升，碳酸氢钠0.2克/升，溴化钠0.375克/升，酵母提取物3克/升，氯化铵2克/升，磷酸二氢钾0.0375克/升，淀粉20克/升，柠檬酸铁铵0.008克/升，微量元素溶液SL-6 1毫升/升；

和/或，所述生产聚羟基脂肪酸酯的方法还包括在发酵前进行菌种活化和种子培养；其中，所述种子培养基的各个组分及其浓度为：

酸水解酪素5-10克/升，酵母提取物5-10克/升，谷氨酸钠1-2克/升，柠檬酸三钠3-6克/升，氯化钠110-220克/升，氯化镁0-9.6克/升，硫酸镁2-30克/升，氯化钾1-5克/升，柠檬酸铁铵0.005-0.01克/升，微量元素溶液SL-6 0.5-1毫升/升。pH调节到6.5-7.5；

和/或，所述种子培养分为两级种子培养；所述种子培养的方法是将所述重组极端嗜盐古菌单克隆接种于一级种子培养基中，37℃培养3天获得一级种子培养液，然后将一级种子培养液以体积百分含量为2%的接种量接入二级种子培养基中，37℃培养3天获得二级种子培养液；

一级种子培养基的各个组分及其浓度为：

酸水解酪素5克/升，酵母提取物5克/升，谷氨酸钠1克/升，柠檬酸三钠3克/升，氯化钠200克/升，七水合硫酸镁20克/升，氯化钾2克/升，柠檬酸铁铵0.008克/升，微量元素溶液SL-6 1毫升/升；所述一级种子培养基的pH是7.0-7.2；

二级种子培养基的各个组分及其浓度为：

酸水解酪素10克/升，酵母提取物10克/升，谷氨酸钠2克/升，柠檬酸三钠6克/升，氯化钠200克/升，七水合硫酸镁20克/升，氯化钾2克/升，柠檬酸铁铵0.008克/升，微量元素溶液SL-6 1毫升/升；所述二级种子培养基的pH是7.0-7.2；

和/或，所述发酵过程中，补加补料培养基；所述补料培养基的各个组分及其浓度为：氯化钠110-220克/升，氯化镁0-10克/升，硫酸镁0-20克/升，氯化钾0-5克/升，氯化钙0-1克/升，碳酸氢钠0-0.3克/升，溴化钠0-0.5克/升，酵母提取物0-10克/升，氯化铵10-100克/升，磷酸二氢钾0-1克/升，淀粉200-500克/升，柠檬酸铁铵0-0.01克/升，微量元素溶液SL-6 0-1毫升/升；

所述微量元素溶液SL-6的各种组分及其含量为：七水合硫酸锌1克/升，四水合氯化锰0.3克/升，硼酸3克/升，六水合氯化钴2克/升，二水合氯化铜0.1克/升，六水合氯化镍0.2克/升，一水合钼酸钠0.3克/升；所述微量元素溶液的pH用盐酸溶液调节至3-4；

和/或，所述发酵时，将所述二级种子培养液接种于所述发酵培养基中，二级种子培养液的接种量为体积百分比为10%的量接种于所述发酵培养基中。