[发明专利]高效利用碳源生产生物塑料PHBV的极端嗜盐古菌工程菌

说明书

技术领域

本发明涉及一种生产聚羟基脂肪酸酯PHBV的极端嗜盐古菌工程菌。

背景技术

聚羟基脂肪酸酯是一类由微生物在营养不均衡时在细胞体内积累的高分子聚酯，作为碳源和能源的储备物广泛存在于自然界。由于其具有热塑性、生物可降解性和生物兼容性，PHA被普遍认为是引起白色污染的石化衍生塑料的潜在替代物，可以应用于包括日常用品（比如塑料袋，容器）和生物医学材料（比如人造血管，药物释放载体）在内的多个领域，且越来越受到科学界和商业界的关注。

目前，细菌中实现PHA产业化生产的主要是PHB、PHBV和P3HB4HB。PHB在某些性能上与热塑性塑料相类似，力学性质与聚丙烯（PP）相类似。经基因工程改造的大肠杆菌菌株VG1（pTU14）利用廉价的淀粉水解糖做碳源，分批流加培养60小时，菌浓度可达216克/升，PHB在菌体内的积累量达细胞干重的90%。此外，血红蛋白的过表达，提高了菌体的摄氧和耐低溶氧的能力；利用裂解基因可控诱导细胞裂解，释放出细胞内的PHB。然而，PHB易折裂的缺点却限制了其应用范围。在PHB中掺入其他单体（如羟基戊酸）可以降低其强度和硬度，材料学性能有了很大改进；但是，生产PHBV过程中丙酸等前体的添加极大的提高了生产成本。

PHBV是羟基丁酸和羟基戊酸的共聚物，虽然基因工程改造的大肠杆菌也可以通过非相关碳源合成PHBV，但随着羟基戊酸组分的增加PHBV的含量也逐渐降低；羟基戊酸组分的摩尔百分含量可达17.5%，但其PHBV含量只占细胞干重的12%左右。P3HB4HB作为一种新的PHA材料已经受到很大关注并正在进行工业化生产。在发酵过程中添加1,4丁二醇或gama-丁酸内酯，细胞体内就会积累P3HB4HB，其中4HB所占的摩尔百分比可控制在0-40%。

极端嗜盐古菌是一类依赖高渗透压环境生长的极端微生物，其作为PHA的生产菌株具有独特的优点：高渗的生长环境可以简化灭菌过程甚至不用灭菌；对高渗环境的依赖使菌体在清水中非常容易裂解，从而使PHA的提取安全、简便。而地中海富盐菌由于其生长速率较其他极端嗜盐古菌快，可以利用淀粉、乳清等多种碳源，能够通过非相关碳源合成PHBV等优点成为极端嗜盐古菌中最合适的PHA生产菌种。1986年，地中海富盐菌被报道可以积累PHA；1990年，Lillo对培养基的组分及培养条件进行了优化。随着其积累的PHA被确定为PHBV(羟基戊酸组分的摩尔百分比最低为10.7%)，地中海富盐菌又逐渐受到人们的关注。以处理后的淀粉和米糠（1:8g/g）为碳源，优化发酵工艺，培养大约120个小时，PHBV浓度达到77.8克/升。虽然在一定程度上节约了碳源的成本，但由于以酵母提取物为氮源，同时通入了纯氧，反而增加了生产的总成本。我们实验室正在尝试分别使用廉价的淀粉和氯化铵做碳源和氮源，同时在只通入空气的情况下对PHBV的生产进行优化。

地中海富盐菌在PHBV发酵生产过程中会产生多种副产品，如胞外多糖。胞外多糖的合成和积累不仅造成了不必要的碳源浪费，而且会对生产产生一些副作用，包括提高了培养液的黏度、增加了起泡量、降低了溶氧。对于地中海富盐菌胞外多糖的研究目前仅限于其生产优化、理化性质、生理功能和组成结构，而在遗传水平却没有报道。考虑到胞外多糖的合成与PHBV的生产条件比较相似，故在遗传水平对菌株进行改造是必需的。

发明内容

本发明的目的是提供一种高效利用碳源生产聚羟基脂肪酸酯PHBV的胞外多糖合成功能缺失的重组极端嗜盐古菌，及一种极端嗜盐古菌胞外多糖合成相关的基因簇。

本发明提供的极端嗜盐古菌胞外多糖合成相关的基因簇，名称为eps，来源于地中海富盐菌Haloferax mediterranei，其保藏编号为CGMCC 1.2087，其编码的蛋白质为如下1）-4）所述的蛋白：

1）由序列表中序列2所示的氨基酸残基序列组成的蛋白质，或者将序列表中序列2的氨基酸残基序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有与序列2所示的蛋白相同活性的蛋白质；

和，2）由序列表中序列3所示的氨基酸残基序列组成的蛋白质，或者将序列表中序列3的氨基酸残基序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有与序列3所示的蛋白相同活性的蛋白质；

和，3）由序列表中序列4所示的氨基酸残基序列组成的蛋白质，或者将序列表中序列4的氨基酸残基序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有与序列4所示的蛋白相同活性的蛋白质；