[发明专利]包含白喉毒素无毒突变体CRM197或其片段的融合蛋白

说明书

技术领域

本发明涉及分子病毒学和免疫学领域。具体而言，本发明涉及白喉毒素无毒突变体CRM197或其片段在融合蛋白中作为分子内佐剂增强与其融合的目的蛋白(例如HEV衣壳蛋白、流感病毒M2蛋白或其免疫原性片段)的免疫原性的用途。本发明还涉及增强目的蛋白(例如HEV衣壳蛋白、流感病毒M2蛋白或其免疫原性片段)的免疫原性的方法，其包括将CRM197或其片段与目的蛋白融合表达，形成融合蛋白。本发明还涉及包含CRM197或其片段以及目的蛋白(例如HEV衣壳蛋白、流感病毒M2蛋白或其免疫原性片段)的融合蛋白，其中CRM197或其片段增强了目的蛋白的免疫原性。本发明还涉及编码所述融合蛋白的分离的核酸，包含所述核酸的构建体和载体，以及包含所述核酸的宿主细胞。本发明还涉及所述融合蛋白的用途，其用于制备药物组合物或疫苗。

背景技术

已对白喉毒素(diphtheria toxin，DT)进行了深入的研究。结构研究显示，白喉毒素由三个结构域组成：N端的催化结构域C(aa 1-190，C domain)(其也称为A片段)，中间转膜结构域T(aa 201-384，Tdomain)，以及C端的受体结合位点结构域R(aa 386-535，R domain)(Choe S,Bennett M,Fujii G,et al.，Nature.1992.357:216～222)。利用白喉毒素的前两个结构域与白介素2(IL-2)融合而制备的ONTAK(DAB389-IL-2)在1999年被美国FDA批准上市，用于成人皮肤T细胞淋巴瘤的治疗。这证实白喉毒素的三个结构域可以进行拆分并发挥其各自的功能。

CRM197(Cross-Reacting Materials 197)是白喉毒素的一种无毒突变体(Uchida，T.，A.M,Pappenheimer，Jr.，R.Grego ry，et al.,J.Biol.Chem.1973.248:3838-3844)，其与编码DT的野生型基因相比存在单个核苷酸突变，导致第52位的氨基酸残基由Gly变为Glu(G.Giannini，R.Rappuoli，G.Ratti et al.,Nucleic Acids Research.1984.12：4063-4070)。

研究表明，CRM197虽然具有与野生型DT类似的结构(即，具有上述3个结构域)，但其A片段丧失了与NAD结合的能力，不能结合EF2并因而丧失了天然DT所具有的细胞毒性，这表明第52位氨基酸残基Gly在DT与NAD的结合中起着重要作用(K.Moyner,G.Christiansen,Acta pathmicrobial immunolscand sect C.1984,92:17-23)。CRM197虽然丧失了细胞毒性，但其却保留了与野生型DT相当的、极强的免疫原性，因此其常被用作蛋白载体，用于与其他半抗原交联从而制备结合疫苗。