[发明专利]基于聚酰胺胺树状大分子载体的基因转染方法

权利要求书

1.一种基于聚酰胺胺树状大分子载体的基因转染方法，包括：

（1）将乳糖酸La溶于磷酸盐缓冲液中，加入1-(3-二甲基氨基丙基)-3-乙基碳化二亚胺盐酸盐和N-羟基硫代琥珀酰亚胺，搅拌反应1-5小时，得到活化好的乳糖酸溶液；将第五代聚酰胺-胺树状大分子G5.NH₂溶于蒸馏水中，得到G5.NH₂溶液，然后将上述活化好的乳糖酸溶液加入G5.NH₂溶液中，室温中搅拌反应1-5天；反应结束后，将反应产物透析，最后进行冷冻干燥，得到反应产物G5.NH₂-La；

（2）将步骤（1）得到的G5.NH₂-La用无菌水稀释，得到G5.NH₂-La的无菌水稀释液；用无菌水将pDNA稀释，得到pDNA的无菌水稀释液，然后将所述的G5.NH₂-La的无菌水稀释液与pDNA的无菌水稀释液混合均匀，再于37℃孵育20-30分钟，得到G5.NH₂-La与质粒的复合物G5.NH₂-La/pDNA；

（3）将HepG2细胞铺于6-96孔培养板中，采用不含FBS的MEM培养基，于37℃、5%CO₂培养20-30小时，然后滴加入G5.NH₂-La/pDNA复合物溶液，摇匀，37℃培养2-5小时后更换为含10%FBS的MEM培养基，继续培养20-30小时，即可。

2.根据权利要求1所述的一种基于聚酰胺胺树状大分子载体的基因转染方法，其特征在于：步骤（1）中所述的磷酸盐缓冲液的pH值为6.0。

3.根据权利要求1所述的一种基于聚酰胺胺树状大分子载体的基因转染方法，其特征在于：步骤（1）中所述的乳糖酸与磷酸盐缓冲液的用量比为15.7mg：2mL。

4.根据权利要求1所述的一种基于聚酰胺胺树状大分子载体的基因转染方法，其特征在于：步骤（1）中所述的EDC、NHS和乳糖酸羧基的摩尔比为5:5:1。

5.根据权利要求1所述的一种基于聚酰胺胺树状大分子载体的基因转染方法，其特征在于：步骤（1）中所述的G5.NH₂溶液中G5.NH₂的浓度为10.4mg/mL。

6.根据权利要求1所述的一种基于聚酰胺胺树状大分子载体的基因转染方法，其特征在于：步骤（1）中所述的乳糖酸与G5.NH₂的摩尔比为7:1～15:1。

7.根据权利要求1所述的一种基于聚酰胺胺树状大分子载体的基因转染方法，其特征在于：步骤（1）中所述的透析为转移至截留分子量为14000的透析袋中，在蒸馏水中透析2天。

8.根据权利要求1所述的一种基于聚酰胺胺树状大分子载体的基因转染方法，其特征在于：步骤（2）中所述的pDNA的无菌水稀释液中pDNA的浓度为0.02-0.10g/L。

9.根据权利要求1所述的一种基于聚酰胺胺树状大分子载体的基因转染方法，其特征在于：步骤（2）中所得到的G5.NH₂-La/pDNA中G5.NH₂的伯氨基与pDNA骨架上磷酸基团摩尔比为0.25-5：1。