[发明专利]基于聚酰胺胺树状大分子载体的基因转染方法

说明书

技术领域

本发明属高分子纳米载体靶向基因转染领域，特别是涉及一种基于聚酰胺胺树状大分子载体的基因转染方法。

背景技术

目前，细胞的表达调控日益受到重视，其中基因转染是实现细胞表达调控的一种重要手段。用于基因转染的载体分为病毒载体和非病毒载体。病毒载体虽然具有较高的转染效率，但因其本身存在免疫原性、高毒性及不能大规模生产等缺点而受到限制。非病毒载体，尤其是聚酰胺胺树状大分子（PAMAM），由于其低毒、高效、可以大规模生产等优点而日益受到重视。在特定部位（如肝组织）的表达调控中，许多基因载体由于无法靶向到特定组织，会降低细胞表达调控的效率，甚至会引起不必要的麻烦。据报道，PAMAM树状大分子经修饰后不仅可以提高转染效率还可以提高其转染特异性。[Santos JL.,Pandita D,Rodrigues J,et al.,Receptor-mediated gene delivery using PAMAM dendrimers conjugated with peptides recognized by mesenchymal stem cells.Mol Pharmaceutics,2010,7,763-774.]。近年来，发展一种具有肝癌细胞靶向功能的纳米载体，实现肝癌细胞的靶向表达调控，已成为研究的热点与难点。

肝癌细胞膜表面特异性表达的去唾液酸糖蛋白受体（asialoglycoprotein receptor,ASGPR）能够专一性识别分子末端带有的半乳糖残基并与之结合。Guo R.等[Guo R,Yao Y，Cheng G,et al.,Synthesis of glycoconjugated poly(amindoamine)dendrimers for targeting human liver cancer cells,RSC Advances,2012,2,99-102.]报道了乳糖酸修饰的聚酰胺胺树状大分子对肝癌细胞具有很好的靶向作用。

聚酰胺胺（PAMAM）树状大分子是一种高度支化的单分散大分子，它具有良好的水溶性，在使用剂量下没有细胞毒性和免疫原性。PAMAM树状大分子表面有大量可控功能基团，可以化学连接或物理吸附一些靶向基团、抗体或药物分子等。乳糖酸（La）是一种含有半乳糖残基的小分子，能够修饰在纳米载体或高分子材料的表面以提高其对肝癌细胞的靶向能力。因此，将乳糖酸修饰在PAMAM树状大分子表面，有望制备一种具有肝癌细胞靶向功能的基因载体，实现肝癌细胞的靶向表达调控。

检索国内外相关文献和专利结果表明：以乳糖酸修饰的聚酰胺胺树状大分子为靶向载体，用于肝癌靶向基因转染的方法，尚未见报道。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是提供一种基于聚酰胺胺树状大分子载体的基因转染方法，该基因转染方法具有转染条件温和，易于操作，转染效率高等优点。

本发明的一种基于聚酰胺胺树状大分子载体的基因转染方法，包括：

（1）聚酰胺胺树状大分子（PAMAM）表面的乳糖酸修饰：

将乳糖酸La溶于磷酸盐缓冲液中，加入1-(3-二甲基氨基丙基)-3-乙基碳化二亚胺盐酸盐EDC和N-羟基硫代琥珀酰亚胺NHS，强磁力搅拌反应1-5小时，得到活化好的乳糖酸溶液；将第五代聚酰胺-胺树状大分子G5.NH₂（Sigma公司）溶于蒸馏水中，得到G5.NH₂溶液，然后将上述活化好的乳糖酸溶液加入G5.NH₂溶液中，室温中磁力搅拌反应1-5天；反应结束后，将反应产物透析，最后进行冷冻干燥，得到反应产物G5.NH₂-La；

（2）乳糖酸修饰的聚酰胺胺树状大分子（G5.NH₂-La）与质粒复合物的制备：

将步骤（1）得到的G5.NH₂-La用无菌水稀释，得到G5.NH₂-La的无菌水稀释液；用无菌水将pDNA稀释，得到pDNA的无菌水稀释液，然后将所述的G5.NH₂-La的无菌水稀释液与pDNA的无菌水稀释液混合均匀，再于37℃孵育20-30分钟，得到G5.NH₂-La与质粒的复合物G5.NH₂-La/pDNA；

（3）乳糖酸修饰的聚酰胺胺树状大分子质粒复合物的细胞转染：