[发明专利]一种鉴别平滑型脂多糖和粗糙型脂多糖的方法

权利要求书

1.一种鉴别平滑型脂多糖和粗糙型脂多糖的方法，其特征在于，该方法按照以下步骤具体实施：

步骤1、根据膜结合型白细胞分化抗原14基因的序列，按照小干扰核糖核酸分子设计的基本原则，合成一对针对膜结合型白细胞分化抗原14的小干扰核糖核酸分子siRNA-224.3；

步骤2、将合成好的siRNA-224.3包装慢病毒载体

2.1）制备寡核苷酸：在Lentivirus-shRNA模板中的loop结构选用TTCAAGAGA；在正义链模板的5’端添加T，与Hpa I酶切后形成的粘端互补；在反义链模板的5’端添加AGCT，与Xho I酶切后形成的粘端互补；T4连接酶连接而成重组载体；

2.2）对Lentivirus-shDNA模板退火，参照表1配置退火体系：

表1Lentivirus-shDNA模板的退火体系

  组分  体积(ul)  10倍T4DNA连接酶缓冲液  5  正义链(100uM)  5  反义链(100uM)  5  水  35  总体积  50

退火条件是：93-95°C时为5-6min；83-85°C时为5-6min；73-75°C时为5-6min；68-70°C时为5-6min；4°C-5°C的环境中保存；将得到的退火产物稀释50-52倍至终浓度为200-220nM，用于连接反应；

2.3）构建Lentivirus-shRNA载体，参照表2配置连接体系：

表2Lentivirus-shRNA载体的连接体系

  组分  体积(ul)  10倍T4DNA连接酶缓冲液  2  XhoI+Hpa I酶切后的慢病毒载体  1  模板(100nM)  1  T4DNA连接酶(5weissU/ul)  1  水  15  总体积  20

在22℃环境中静置1h后，转化DH5α；

2.4）转染重组质粒以及制备病毒液

293T细胞常规培养于10%的FBS+DMEM，37℃，5%的CO₂环境条件中；在转染前一天按3×10⁶cell/皿的密度接种293T细胞于10cm dish中，使转染时细胞密度能达到90%-95%，每皿加9ml的10%FBS+DMEM，37℃，5%的CO₂环境中培养过夜；

2.4.1）转染前2h将6皿细胞进行换液，10%FBS+DMEM，每皿5ml；

2.4.2）取2个无菌的1.5ml的EP管，分别加入500ul的无血清DMEM，并标记为①、②号管；

2.4.3）往①号管中加入穿梭质粒pGLV-U6-EGFP-shRNA-224共40ug，包装质粒，PG-P1-VSVG、PG-P2-REV以及PG-P3-RRE三者共42ug，总计82ug，将两者混匀；往②号管中加入65×6=390ul的转染试剂RNAi-mate，混匀，室温静止5min；

2.4.4）5min后，将②号管液体缓慢的加入到①号管中，并轻轻的混匀，室温静止20min；

2.4.5）在20min期间，将各皿293T细胞的上清液弃掉，并用预热的PBS洗两遍，用tip头吸去剩余液体，然后每皿细胞加入5ml预热的DMEM培养基；

2.4.6）20min后，将①号管内的混合液平均分到各皿细胞中，然后放入37℃，5%的CO₂培养箱中；

2.4.7）转染6h后，将各皿细胞上清液吸掉，加入10ml新鲜的10%FBS+DMEM，然后放入37℃，5%的CO₂培养箱，培养72h；

2.4.8）转染72h后，将6个10cm的dish细胞上清液共60ml全部吸到两个50ml离心管中，然后进行低速离心，离心转速1800-1850rpm，离心时间3-3.5min；

2.4.9）低速离心后，取上清液经0.45um的过滤器过滤；

2.4.10）过滤后，取15ml病毒液到纯化管内进行高速离心，离心转速8000-8200rpm，离心时间16-18min；

2.4.11）去除底部的废液，将剩余病毒液加入到超滤管内进行第二次高速离心，离心转速8000-8200rpm，离心时间20-22min；离心到上清液到1ml，即病毒纯化液1ml，分装5管，每管200ul，-80℃条件保存；

步骤3、慢病毒感染小鼠巨噬细胞RAW264.7细胞，构建稳定细胞系，具体步骤是：

3.1）感染前一天用完全培养基将0.5×10⁵个细胞/孔铺于24孔板；

3.2）移去细胞培养液，以MOI=10，加入稀释后的病毒液0.5ml，在37℃、5%的CO₂条件下过夜；

3.3）24h后移去细胞培养液，每孔加入0.5ml的完全培养液，在37℃、5%的CO₂条件下过夜；

3.4）RAW264.7细胞感染96h后，加入终浓度为1-1.1ug/ml的嘌呤霉素筛选，24h后换完全培养基，根据细胞状态换液，直至单克隆形成，并在显微镜下挑取各阳性克隆扩增培养；

步骤4、采用实时荧光定量聚合酶链式反应技术检测稳定细胞系信使核糖核酸的表达水平；采用蛋白质印迹检测稳定细胞系蛋白表达水平，具体步骤是：

4.1）收集细胞用于总RNA提取：吸出培养液，用磷酸盐缓冲液洗涤细胞2次，加1ml的Trizol反复吹打细胞后收集液体，设计引物采用上海生工相应的合成物品；

根据核糖核酸提取试剂盒说明书分提取总核糖核酸；使用第一链试剂盒合成互补脱氧核糖核酸；采用ABI-7500系统，使用荧光定量聚合酶链式反应试剂盒，利用比较CT法来测定膜结合型白细胞分化抗原14的表达水平；

4.2）收集蛋白进行蛋白质印迹检测稳定细胞系蛋白表达水平，具体步骤包括：洗掉培养基，用磷酸盐缓冲液洗涤细胞2次，加入0.25%胰酶-0.02%EDTA消化3min，再加入1ml的完全培养基终止消化，吹打细胞使其从壁上脱落；在1000-1050rpm条件下离心细胞，弃上清液，磷酸盐缓冲液重悬细胞，再次离心弃上清液后，加入一定量的IP裂解液，其中含千分之一的蛋白酶抑制剂PMSF在冰上裂解细胞，反复吹打；在12000-12500rpm条件下离心取上清液；利用二喹林甲酸蛋白测定试剂盒测定总蛋白浓度，将总蛋白等量上样，在12%的分离胶的浓度下进行聚丙烯酰胺凝胶电泳，电泳完毕后进行蛋白质印迹；

步骤5、分别用S-LPS和R-LPS800ng刺激细胞系，收集细胞培养上清液，Elisa检测细胞因子NO、TNF-α和IL-6，具体步骤如下：

5.1）将RAW264.7、siRNA-224.3细胞系和siRNA-NC细胞系用无双抗培养基以2×10⁵个细胞/孔铺于两块12孔板，在37℃、5%的CO₂条件过夜；

5.2）在两块12孔板分别加入800ng的S-LPS和800ng的R-LPS，轻轻摇匀后，在37℃、5%的CO₂条件下培养6-6.5小时，收集细胞培养上清液；

5.3）根据试剂盒说明书，检测细胞因子一氧化氮、肿瘤坏死因子α和白细胞介素6，NO LPS组即阴性对照组为：RAW264.7、siRNA-NC、siRNA-224.3；S-LPS刺激组：RAW264.7、siRNA-NC、siRNA-224.3分别用S-LPS刺激；R-LPS刺激组：RAW264.7、siRNA-NC、siRNA-224.3分别用R-LPS刺激，即成。