[发明专利]一种应用于结核病快速诊断的糖芯片、其制备方法及采用其的结核病诊断试剂盒

说明书

技术领域

本发明涉及生物医药体外诊断试剂领域，更具体地讲，涉及一种应用于结核病快速诊断的糖芯片，其制备方法及采用其的结核病诊断试剂盒。

背景技术

我国是结核病的高感染，高发病率国家，结核病的患病人数在世界各国中居于第二位。目前结核分枝杆菌临床检测方法有细菌学检测、血清学检测和基因诊断。结核病患者的细菌学检测是结核病诊断、治疗及评价治疗效果的可能手段，该手段包含BACTEC检测系统、分枝杆菌生长指示系统、噬菌体报告技术。该手段的检测方法即使是在缩短了检测时间这一缺点后仍存在一些不可能推广的问题，如需要昂贵的设备、标准化的细菌等。基因诊断对肺结核病检测、结核分枝杆菌菌种鉴定、耐药性监测等具有较高的特异性且需要的时间较短，但是因其高特异性反而容易出现假阴性的结果且有部分实验手段所需仪器昂贵等因素限制了其的普及，该手段主要包含结核分枝杆菌DNA扩增法、实时荧光定量PCR技术、PCR-RFLP、DNA探针技术和生物芯片技术。血清学检查因其取样方便、操作简单、快速、不依赖病原菌的检查，是临床诊断结核病的重要辅助手段，但特异性免疫诊断依赖于特异性抗原。结核病感染进程中体液免疫动态变化规律很复杂，缺少抗原优化组合的理论基础，而传统的血清抗体检测由于标记和检测技术落后，所以检测灵敏度不高。

目前商品化的组合抗体检测试剂盒，多用特异蛋白质抗原与血清中的抗体结合，无法检测出所有结核患者血清中抗结核抗体。这些检测方法都存在时间、特异性等方面的问题，不能快速准确的检测出患者所携带的结核分枝杆菌，给结核病的治疗和控制带来了很大的不便。因此，寻找快速、准确的诊断结核病的新方法是控制结核病的重要手段。

糖芯片是继基因芯片和蛋白芯片之后诞生的新型生物技术，具有需要的样品量少、高通量和高特异性等优点，其基本原理与基因芯片和蛋白芯片相似,都是基于物质之间的特异性作用。它是将多个不同结构的糖分子通过共价或非共价作用固定于经化学修饰的基质上，进而对蛋白质、糖蛋白等待测样品进行测试、分析的一类分析方法。优越性在于：其一，生物活性稳定。糖芯片可在室温条件下长期保存生物活性不变。其二，应用范围广泛。把糖芯片技术应用于医学临床上，可对多种传染性与非传染性疾病同时进行快速诊断。因为所有的细胞表面都含有糖类物质，这些糖类分子在细胞分子的识别过程中起着重要的作用。

具有种属特异性的结核分枝杆菌细胞壁成分脂阿拉伯甘露聚糖（lipoarabinomannan,LAM）、脂甘露聚糖（lipomannan,LM）是结核感染过程中重要的免疫反应调节因子，是结核分枝杆菌与巨噬细胞和树突状细胞作用的重要配体，其作为结核分枝杆菌的重要抗原，一直是结核病发病机制、免疫病理、诊断治疗的研究靶点。国外研究者对LAM-IgG检测用于结核病诊断做过研究,并开发出相应的诊断试剂盒。国内也有学者开展了类似研究，但多是直接购买国外的抗原或试剂盒开展应用评估。依赖进口试剂，价格较为昂贵，限制了此项诊断技术的应用推广。

本发明旨在自主开发的糖芯片技术的基础上，利用肟化反应固定糖探针的方法，将纯化得到的脂多糖抗原固定在固相载体上，并运用于血清学诊断，建立一种快速，准确基于糖芯片技术的结核病快速诊断试剂盒，为结核病防控提供有效手段。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是，提供一种特异性好、灵敏度高且适用于大规模检测的基于二种脂多糖类抗原与抗体的结核病快速检测方法。

为了解决上述问题，本发明的一个目的在于提供一种用于结核病快速诊断的糖芯片，其包括固相载体，其特征在于，所述糖芯片还包括结核分枝杆菌脂多糖类抗原探针，所述结核分枝杆菌脂多糖类抗原探针通过肟化反应被固定于所述固相载体上。

在一实施方式中，所述结核分枝杆菌脂多糖提取自结核分枝杆菌H₃₇Rv菌株。

在一实施方式中，所述结核分枝杆菌脂多糖为脂多糖LAM和LM。

在一实施方式中，所述固相载体是经过化学改性的硝酸纤维膜或微孔板。

在一实施方式中，所述固相载体的化学改性是根据如下步骤进行：

（1）将固相载体用环氧硅烷/甲苯溶液浸润，形成环氧化物功能的单层膜；

（2）将上述得到的固相载体用α,ω-二胺-聚乙二醇(M_W=2000)溶液处理，使固相载体上覆盖一层带伯氨基的聚乙二醇单层分子；

（3）将氨基化的固相载体置于叔丁氧羰基氨氧基乙酸、乙烯和N-羟基琥珀酰亚胺的磷酸缓冲液处理，洗涤后用HCl/醋酸处理，使伯氨基通过化学改性转换成羟胺。