[发明专利]碱性磷酸酶标记信号放大系统

说明书

技术领域

本发明涉及一种超灵敏的信号倍增系统，具体地说，涉及一种新的碱性磷酸酶标记信号放大系统。

背景技术

酶作为灵敏的标记物已被广泛用于各种生化检测系统，如免疫测定（ELISA），核酸测定（PCR和基因测序）等，其酶活力大小可用在一定条件下催化某一化学反应的速度来表示，催化反应速度愈大，活力愈高，反之则活力愈低，因此，测定酶活力实际就是测定酶促反应的速度。酶促反应速度常用单位时间内、单位体积中底物的减少量或产物的增加量来表示，单独一个酶分子可以催化大量底物（如一分子高纯度酶在lmin内可催化10000-1000000分子的底物），因而通过对产物生成及底物或共反应物消耗来反应的酶活力，检测的不是酶本身，而是大量生成的底物或消耗的产物，从而提供了高度放大的信号。

目前利用工具酶结合其他分析检测手段的信号放大技术因其具有特异、灵敏、简便、快速等特点，已在生物医学研究领域及临床疾病的诊疗中得到广泛应用。相较于放射免疫（RIA）技术，酶联技术具有试剂半衰期长，对环境污染小，试验废物易于处理等优点，但其测定敏感性仍比不上RIA技术，在一些方面尤其在微量物质测定方面还不能替代RIA。但由于放射性物质对人体、环境有极大危害，并且其操作和处理极为不便，因此，如何提高酶联技术的测试灵敏度，使其达到甚至超越RIA技术，一直是科研界的研究热点。

酶循环法是在原始标记酶催化基础上附加了一个反应系统（如酶底物反应循环或酶级联反应），利用酶的底物特异性来放大靶物质（被测物）的测定方法。传统的酶反应只能按靶物质的量生成相应的产物量，而酶循环法则可在一定的反应时间内通过靶物质的重复反应来增加产物的量。因此，通过延长反应时间和／或增加酶的用量可加速循环，增加循环次数，从而提高检测灵敏度。这种由数个催化反应耦联而构建的放大系统，是酶循环法标记技术放大的根本之所在，其敏感性的提高来源于真正的信号放大，而不是简单地将一个分子转变为更多的易于测定的分子，并且酶循环法仅循环靶物质，减少了样品中存在的其它物质对测定的干扰，因此不需要对样品进行预处理或对靶物质进行提取，是一种临床应用前景十分广阔的测定技术。

单分子检测一直是科学家长期以来梦寐以求的一项富有挑战性的前沿领域，其技术的实现可使检测灵敏度达到极限，在低含量物质检测中更是具有里程碑的意义。酶循环法通过偶联数个催化反应，可使单一底物通过循环反应生成大量的产物，从而实现高度的信号放大。因此，将酶循环法运用至酶标技术中，可实现酶标技术质的飞跃，大大的提高其检测灵敏度，实现对微量甚至是痕量物质的检测，进一步可以替代RIA法，实现技术更替。

自1971年Engvall等学者创立了酶免疫分析技术以来，至今已有二十多种酶被应用于此项技术，其中碱性磷酸酶因具有高活性、高敏感性，在室温下稳定，反应产物易于显现，能商品化生产，染色背景低等优点，应用日益广泛，尤其在免疫检测、核酸测定等方面。

发明内容

本发明针对现有酶联技术灵敏度低的不足，提供了一种通过循环酶法放大碱性磷酸酶标记信号的系统即碱性磷酸酶标记信号放大系统。

为了解决上述技术问题，本发明采用的技术方案为：一种碱性磷酸酶标记信号放大系统，包括：

（1）一种碱性磷酸酶底物，其结构通式如下式（I）所示：

其中：

A是烷基，烯烃基或炔烃基中的一种；

R为H，C1-C4烷基，C5-C10环烷基中的一种；

n是1-8的整数；

通式（I）的化合物在碱性磷酸酶作用下可以水解成结构通式如(II)的化合物和磷酸；

当n为1时，通式(II)化合物就可以表示为通式如下所示的(IIB)的化合物：

如果R为H，则羟基所连接的为伯碳，此时(IIB)为一级醇；

一级醇在氧气的参与下被醇氧化酶（EC1.1.3.13）氧化成醛化合物，而生成的醛化合物在辅酶NADH及醇脱氢酶（EC1.1.1.1）作用下又可被还原成醇化合物，反应过程如下反应式（I）所示：

反应式（I）

如果羟基所连接的为仲碳，则此时(IIB)为二级醇；

二级醇在氧气参与下被二级醇氧化酶（EC1.1.3.18）氧化成酮化合物，而生成的酮化合物在辅酶NADH及S-二级醇脱氢酶（EC 1.1.1.B3）作用下又可被还原成醇化合物，反应过程如下反应式（II）所示：

反应式（II）。