[发明专利]一种猪流感灭活疫苗的效价测定方法

说明书

技术领域

本发明一种疫苗效力的检验方法，特别涉及一种猪流感灭活疫苗的效价测定方法，属于兽用生物制品领域。

背景技术

猪流感（Swine Influenza,SI）是由正黏病毒科A型流感病毒引起的一种急性、高度接触传染性的猪呼吸道传染病。在临床上该病以突发性咳嗽、发热、呼吸困难、衰竭、迅速康复或死亡为特征。该病可发生于各年龄和各品种的猪，发病率可高达100%。SI不仅使患猪生产性能下降，肉料比降低，直接影响猪群健康状态，引起猪只死亡，而且猪流感病毒对猪呼吸道上皮细胞有高度的亲嗜性，感染后使猪体的呼吸道天然屏障被破坏，导致猪呼吸与繁殖综合征病毒、猪呼吸道冠状病毒、猪胸膜肺炎放线菌等多种细菌或病毒的并发或继发感染，使疫情更为复杂和加重。另外，SI还是猪主要的免疫抑制性疾病之一，可造成人工、饲料和药物的巨大浪费，导致巨大的经济损失。

使用灭活疫苗接种是控制猪流感的有效办法，然而目前国内尚无商品化的猪流感灭活疫苗，确定疫苗的效力检验方法是研制疫苗的关键技术。目前国内研究单位用于检验疫苗效力的方法有攻毒保护试验，该方法所需时间较长，可控性差，评价结果时常因使用的动物级别不同，检验结果也常有误差。

无法快速、准确地确定猪流感疫苗的效价，已经成为研制猪流感疫苗的难点。

发明内容

本发明的目的在于提供一种猪流感灭活疫苗的效价测定方法。

本发明所采取的技术方案是：

一种猪流感灭活疫苗的效价测定方法，包括如下步骤：

1)  使用猪流感灭活疫苗免疫猪，免疫后21～28日后采血分离血清；

2)  去除血清中的非特异性成分，得到待检血清；

3)  将猪流感灭活抗原稀释，配制浓度为4 HA单位猪流感抗原稀释液；

4)  将待检血清稀释，将血清稀释液与4 HA单位猪流感抗原稀释液、红细胞混合，进行血凝抑制实验，以完全抑制4 HA单位猪流感抗原的血清最高稀释度为HI效价。

优选的，所述方法包括如下步骤：

1)  使用猪流感灭活疫苗免疫猪，免疫后21～28日后采血分离血清；

2)  将血清与受体破坏酶（RDE）混合，37℃水浴去除血清中非特异性成分；

3)  将血清移至56℃水浴30min灭活残留的RDE，加入鸡红细胞，20～25℃下吸附血清中残余的非特异性成分；

4)  将去除了非特异性成分的血清离心，取上清，上清即为待检血清；

5)  将猪流感灭活抗原进行稀释，之后加入鸡红细胞悬液，在血凝板震荡均匀后于20～25℃下静置20～30 min，以红细胞完全凝集的最高稀释倍数为血凝价；

6)  根据测得的血凝价配制浓度为4 HA单位猪流感抗原稀释液；

7)  将待检血清稀释，加入4 HA单位猪流感抗原稀释液和鸡红细胞，同时设置阴性对照，进行血凝抑制实验，以完全抑制4 HA单位猪流感抗原的血清最高稀释度为HI效价。

优选的，步骤3）中，加入鸡红细胞使血清中红细胞的体积浓度为5%～20%。

优选的，步骤5）和7）中，鸡红细胞的体积浓度为1%。

本发明的有益效果是：

首先，本发明采用了测定经RDE处理的血清中红细胞凝集抑制效价的方法来评价疫苗的免疫效力。该方法大大缩短了测定时间，操作误差小，可控性强，批间差异小，同时也减少了用动物攻毒保护试验来检验效力时常常因为实验动物级别不同，检测结果常有的误差。

其次，本发明的红细胞凝集抑制效价的测定方法简便、快速、具有特异性强等特点，可用于疫苗免疫效力检验。

具体实施方式

下面结合实施例，进一步说明本发明。

猪血清的获得和预处理：

1)  用35日龄阴性（HI亚型流感HI抗体效价≤1:20）易感仔猪5头，各颈部肌肉分左右两点注射猪流感灭活疫苗（H1N1）3 ml，接种后21日，连同对照猪5头采血，分离血清；

2)  为去除血清中非特异性成分，将血清与受体破坏酶（RDE）按1︰4的体积比例混匀，置于37℃水浴中作用16～18h后，移至56℃水浴30min灭活残留的RDE，取出后冷却；

3)  加入浓的鸡红细胞，使其终浓度为5%～20%，在室温下吸附30min以去除其他非特异性成分；

4)  然后低速离心（2000r/min）5～10min，吸取上清，即1︰5稀释的待测血清，备用。