[发明专利]一种应用自诱导培养基和双温度调控策略生产胞外普鲁兰酶的方法

权利要求书

1.一种应用自诱导培养基和双温度调控策略生产胞外普鲁兰酶的方法，其特征在于将重组大肠杆菌E. coli BL21 (DE3)/ pET28a(+)-pul A接种于自诱导培养基中，并采用双温度调控方式，即将接种之后的自诱导培养基于37℃、200 rpm培养2~4小时后，将培养的温度降低到25℃继续培养48~72小时，培养结束后，收集发酵上清液获得胞外普鲁兰酶；步骤为：

（1）将来源于黑座克雷伯氏菌（Klebsiella variicola）CCTCC NO：M 2012108的普鲁兰酶基因在大肠杆菌中进行重组表达：

a、普鲁兰酶基因的获得

CCTCC NO：M 2012108培养基：可溶性淀粉 10 g/L，蛋白胨15 g/L，酵母膏5 g/L，KH₂PO₄ 5 g/L，MgSO₄·7H₂O 0.1 g/L，NH₄Cl 0.5 g/L，FeSO₄·7H₂O 0.1 g/L，用超纯水配制，pH 6.5；

CCTCC NO：M 2012108菌种接种于培养基装液量为10%的250 mL摇瓶中，于37℃、200 rpm振荡培养72 h；培养结束后，将菌体离心并用生理盐水洗涤两次，收集细胞利用VIOGENE公司的基因组DNA提取试剂盒Genomic DNA Extraction Miniprep System提取基因组DNA；

黑座克雷伯氏菌（Klebsiella variicola）CCTCC NO：M 2012108普鲁兰酶，其基因的核苷酸序列为：SEQ ID NO：1，其氨基酸组成为SEQ ID NO：2；

合成引物1：5'- CGG CTA GCA TGC TCA GAT ATA CCT GTC ATG G -3'，引物1含有NheI 限制性酶切位点；

合成引物2：5'- CCG GAA TTC CGT TTA CTG CTC ACC GGC G -3'，引物2含有EcoRI 限制性酶切位点；

PCR反应体系：ddH₂O 37 μL，10×Reaction Buffer 5 μL，25 mmol/L的dNTP 0.5 μL，50 pmol/μL引物1：1 μL，50 pmol/μL引物2：1 μL，基因组DNA 5 μL，5 U/μL的Taq DNA polymerase 0.5 μL；

PCR反应过程：94℃ 预变性5 min；98℃ 10 s，55℃ 1 min，72℃ 4 min，进行30个循环；72℃延伸10 min；

利用上海申能博彩生物科技有限公司的3S Spin Agarose Gel DNA Purification Kit纯化DNA片断：

DNA溶液中加入1/10体积的3 mol/L、pH 5.2的乙酸钠溶液和2倍体积无水乙醇，-20℃沉淀1小时；于4℃、12000 rpm离心30 min；加入75%乙醇500 μL洗涤，于4℃、12000 rpm离心30 min，无菌操作台吹干后溶于适量TE缓冲液中，立即使用或-20℃保存；

b、含有普鲁兰酶基因的重组大肠杆菌的构建

将CCTCC NO：M 2012108普鲁兰酶编码基因与质粒pET28a(+)连接，重组质粒转化大肠杆菌E. coli BL21(DE3)感受态细胞，通过含有50 μg/mL 卡那霉素的LB平板筛选获得含有目的普鲁兰酶基因的重组大肠杆菌E. coli BL21 (DE3)/ pET28a(+)-pul A；步骤为：

目的基因及质粒pET28a(+)的酶切：

利用质粒提取试剂盒Mini-Plasmid Rapid Isolation Kit，北京博大泰克生物基因技术有限公司提供，提取质粒pET28a(+)；

按照水、缓冲液、PCR产物或质粒DNA、酶的顺序加到Eppendorf管中，盖好管盖，振荡使液体充分混匀，置于离心机内离心2 s使液体集中于管底，37℃水浴3 h，在管中加入1/10的Loading Buffer或将管置于65℃保温10 min，终止酶切反应；酶切产物进行琼脂糖凝胶电泳分析并切胶回收目的片段，浓缩；

反应体系组成：10×H Buffer 4 μL，DNA 10 μL，NheI 2 μL，EcoRI 2 μL，ddH₂O将体系补足40 μL；

目的基因与质粒pET28a(+)的连接：

将CCTCC NO：M 2012108普鲁兰酶编码基因与质粒pET28a(+)连接，反应体系组成如下：质粒pET28a(+) 0.8 μL，外源基因4.2 μL，Ligation Solution 5 μL；混合连接液，将其置于16℃培养箱中连接12 h；

利用限制性内切酶NheI 和EcoRI对扩增得到的CCTCC NO：M 2012108普鲁兰酶编码基因与载体pET28a(+)进行双酶切处理，处理后DNA片断通过粘性末端连接获得带有目的基因片断的重组质粒pET28a(+)-pul A；

重组质粒转化大肠杆菌：

在100 μL大肠杆菌E. coli BL21(DE3)感受态细胞悬液中加入10 μL连接产物，轻轻混匀，冰浴中静置30 min；转入42℃水浴中，热击90 s；快速转移至冰浴中，冷却2 min；加入700 μL LB液体培养基，37℃ 100 rpm摇床温育培养1 h；培养后菌液3000 rpm离心2 min，弃上清600 μL，剩余菌液混匀后涂布到含有50 μg/mL 卡那霉素的LB平板上，37℃倒置培养；获得含有目的普鲁兰酶基因的重组大肠杆菌E. coli BL21 (DE3)/ pET28a(+)-pul A；

（2）重组大肠杆菌的自诱导培养和双温度调控发酵产酶

自诱导培养基：α-乳糖 10-20 g /L，葡萄糖 0.5-1 g /L，甘油 5 g /L，KH₂PO₄ 6.8 g /L，MgSO₄ 0.24 g/L，蛋白胨 10 g /L，Na₂HPO₄·12H₂O 17.9 g/L，Na₂SO₄ 0.71 g/L，NH₄Cl 2.67 g/L，痕量元素溶液 200 μL/L，用超纯水配制；

痕量元素溶液：含50 μM FeCl₃，20 μM CaCl₂·2H₂O，10 μM MnCl₂·4H₂O，10 μM ZnSO₄·7H₂O，2 μM CoCl₂·6H₂O，2 μM CuCl₂，2 μM NiCl₂，2 μM Na₂Mo₇O₂₄，2 μM Na₂SeO₃和2 μM H₃B₄O₇，用超纯水配制；

产酶的培养条件为：将重组大肠杆菌E. coli BL21 (DE3)/ pET28a(+)-pul A于含有50 μg/mL卡那霉素的LB固体培养基上过夜活化培养，从固体平板上挑取单个菌落接种于3 mL含有50 μg/mL卡那霉素的液体LB培养基中于37℃、200 rpm振荡培养，随时监测培养基中OD₆₀₀的变化情况，待OD₆₀₀达到2~3时，按5%~10%接种量接种于50 mL含50 μg/mL 卡那霉素的自诱导培养基中，将接种之后的自诱导培养基于37℃、200 rpm培养2~4小时后，将培养的温度降低到25℃继续培养48~72小时，培养结束后，10000 rpm离心去除菌体，收集发酵上清液为普鲁兰酶的粗酶液。

2.根据权利要求1所述应用自诱导培养基和双温度调控策略生产胞外普鲁兰酶的方法，其特征在于发酵生产胞外普鲁兰酶的优化自诱导培养基组成为：

α-乳糖 20 g/L，葡萄糖 1 g/L，甘油 5 g/L，KH₂PO₄ 6.8 g/L，MgSO₄ 0.24 g/L，蛋白胨10 g/L，Na₂HPO₄·12H₂O 17.9g/L，Na₂SO₄ 0.71 g/L，NH₄Cl 2.67 g/L，Tween-80 9 g/L，痕量元素溶液200 μL/L，用超纯水配制；

工程菌E. coli BL21/pET28a(+)-pulA产酶的优化培养条件为：起始pH5.0~8.0，装液量10%~20%，培养温度为37℃、200 rpm先培养4小时后，再转入25℃培养56小时；

采用优化自诱导培养基和双温度发酵条件后，胞外普鲁兰酶酶活达到60~70 U/mL。