[发明专利]一种应用自诱导培养基和双温度调控策略生产胞外普鲁兰酶的方法

说明书

技术领域

一种应用自诱导培养基和双温度调控策略生产胞外普鲁兰酶的方法，属于微生物发酵生产普鲁兰酶的技术领域。

背景技术

普鲁兰酶（pullulanase，EC 3.2.1.41）是专一性分解普鲁兰、淀粉、支链淀粉和相应分支低聚糖中α-1,6-糖苷键的一种脱支酶。与其他普鲁兰水解酶相比，普鲁兰酶特异地水解普鲁兰中α-1,6-糖苷键，生成以麦芽三糖为主的末端产物。该性质决定了它在改善淀粉酶对淀粉的作用效果、提高淀粉利用率、降低粮耗、提高产品质量及开发新的产品方面有着相当巨大的价值，在淀粉加工工业、食品、洗涤剂、纺织等中有着重要的用途和良好的市场前景。

普鲁兰酶最早是Bender在出芽短梗霉（Aureobasidium pullulans）的发酵液中发现并对其酶学性质做了研究。此后，科研工作者从自然界中分离得到了大量产普鲁兰酶的微生物及植物。这些来源的酶性质差别较大，如来源于Klebsiella planticola，最适pH在5.0，最适温度在40℃；而来源于植物的普鲁兰酶（称R-enzyme），最适的pH和温度分别是5.6和37℃。尽管如此，从普鲁兰酶的发现到20世纪70年代末，普鲁兰酶的研究一直处于产酶微生物的筛选和酶学性质的鉴定上，并没有出现普鲁兰酶的规模化生产。直到20世纪80年代初，丹麦诺维信公司从马来西亚的土壤中筛选到一株可以产普鲁兰酶的芽孢杆菌（Bacillus acidopullulytics）。该菌株所生产的普鲁兰酶具有耐热耐酸的特性（60℃，pH4.5）比较适合于淀粉糖化工业的需要。此后，诺维信公司投入巨资对该普鲁兰酶进行研究，并于1983年在日本和欧洲市场同时推出商品化的普鲁兰酶（商品名为Promozyme）。目前，诺维信公司占据了中国乃至世界的普鲁兰酶市场。直到1995年杰能科公司利用地衣芽孢杆菌异源表达了Bacillus deramificans的普鲁兰酶，其酶学性质与B. acidopullulytics普鲁兰酶相近，从而使杰能科成为了普鲁兰酶的第二大生产商。

由于普鲁兰酶工业化生产菌株较少，我国在普鲁兰酶上的研究主要集中在产普鲁兰酶菌株的筛选、诱变及优化等方面，效果均不太理想。如1998年山东大学肖敏等人从白酒发酵现场分离得到一株产普鲁兰酶的微生物，其生产的普鲁兰酶耐热性较差，当温度大于50℃后迅速失活，但是pH稳定性较好，在中性和微酸性条件下可于冰箱中长期保存。2001年唐宝英等人从土壤中分离得到一株产普鲁兰酶的芽孢杆菌，其产普鲁兰酶有较好的酶学性质（75℃，pH 4.6），但是野生菌株的产酶能力不高，只有1.6 U/mL，经过诱变育种最终才使其产酶水平提高到8.8 U/mL。近年来随着分子生物学发展，人们开始利用基因工程手段表达外源普鲁兰酶基因，如2006年夏子芳等利用大肠杆菌表达系统表达海栖热袍菌的普鲁兰酶基因，但仅获得胞内酶活；2008年张明焱等将来源于Bacillus licheniformis的普鲁兰酶编码基因克隆到大肠杆菌中进行表达，但是最终的酶活也只有5.6 U/mL；2010年，王淑军等利用大肠杆菌的表达系统实现了来源于深海古菌Thermococcus siculi HJ21的普鲁兰酶编码基因的异源表达，但是异源表达的效果较差，且仅获得胞内酶活。综上所述，在普鲁兰酶的微生物发酵生产过程中，不论是野生菌还是工程菌，主要存在的问题就是胞外酶活较低，造成了普鲁兰酶的生产成本上升，形成工业化生产的障碍。