[发明专利]蛋白C（PC）测定试剂盒（发色底物法）

说明书

技术领域

本发明涉及生物技术领域，特别涉及一种发色底物法检测蛋白C活性的试剂盒。

背景技术

蛋白C（简称PC）是一种维生素K依赖性蛋白，在Ca²⁺存在的条件下，能被凝血酶-凝血酶调节蛋白激活转化成有活性的蛋白C（简称APC）。APC能通过蛋白水解作用灭活活化的凝血因子Ⅴa（简称FⅤa）和Ⅷa（简称FⅧa），从而显示出较强的抗凝活性；同时通过释放血管血纤维蛋白溶酶原激活剂来促进纤溶。PC的缺乏会使人体的凝血及纤溶平衡受影响，使凝血亢进，从而发生血栓性疾病。

血浆PC水平的降低易引起弥散性血管内凝血（DIC）和肝脏疾病，如肝硬化和慢性肝炎。近年来，人们发现许多临床疾病均可伴随PC水平的改变，如肾功能衰竭、外科手术、炎性反应、口服抗维生素K类抗凝药、缺血性心脏疾病、脑血管疾病、静脉血栓形成以及白血病等。由此可见，很有必要建立一种能准确检测血浆中PC活性的简便方法，用于上述各类疾病的辅助诊断。

根据检测原理，目前用于定量检测蛋白C的方法可归纳为三大类：

（1）根据PC的抗原特性而形成的免疫学方法，包括双抗体夹心酶联免疫吸附法（ELISA）、放射免疫分析法、火箭免疫电泳法等，其中使用最为广泛的是ELISA法，通过采用单抗或多抗进行抗原-抗体反应来检测PC抗原含量。该方法能够准确检测PC抗原含量，但是存在着一定的缺陷。首先，需要高度纯化的PC来获得特异性抗体，因为不纯的抗原中所含血浆蛋白杂质会导致抗体的专一性不强，这会使得检测结果偏高；其次，该方法操作繁琐，检测时间很长，不能满足急诊和临床病人及时诊断和治疗的需要；最后，该方法还有一定的局限性，它同时也检测了PC的病理形态，如与抑制剂连接的或灭活的PC，因此不能准确判断所检测的PC是否有正常活性。

（2）根据PC抗凝活性形成的APTT凝固法。该方法使用蛇毒激活PC后，加入到血浆凝固体系中，能够延长血浆凝固时间，延长比例对应着样品中PC含量。该方法能专一性检测功能性PC，但是该方法的干扰因素多，检测结果变数较大，其结果的判断往往以检验人员的经验而定，直接影响测定结果的准确性和重复性。

（3）采用APC专一性的合成多肽作为底物的酶学方法，即发色底物法。早期采用凝血酶-凝血酶调节蛋白（T-TM）作为激活剂。该方法不能直接检测血浆中的PC活性，因为血浆中包含有PC抑制剂和其他干扰物质，易在活性检测过程中与合成肽底物反应。因此，必须事先通过抗体柱或吸附将PC从血浆中分离出来，这一过程不仅需要大量的血浆，而且也需要大量的时间及人力，该方法不适用于大批量样品的快速处理。目前，国外已开发使用蛇毒激活剂代替T-TM，它能快速激活人和牛血浆PC，激活机制可能与凝血酶类似，但不受其它凝血因子的干扰，也不水解底物。它的快速激活作用使得PC抑制剂的作用降至最低，并因此排除了吸附分离PC的必要性，从而加速PC活化过程，克服了用T-TM作激活剂时激活时间太长，操作繁琐的缺陷。

目前，蛋白C活性定量检测的方法主要采用发色底物法，该方法能准确、特异地反映PC活性，不仅结果真实稳定，而且操作简便易行，具有快速的优点，只需数分钟就能完成检测。但由于目前市售的此类试剂盒中所采用的激活剂绝大多数是从铜头蝮蛇（Agkistrodon contortrix）毒中分离纯化而得，该种类蛇多分布在美国东南部及墨西哥东北部，国内对于该蛇毒的获得比较困难，因此这种激活剂无法在国内大批量生产和应用。近期，有文献报道从皖南蝮蛇蛇毒中分离提纯的PC激活剂具有用于临床PC活性检测的前景，但实验证明该激活剂对血浆中其它凝血因子有部分激活，易受多种因素干扰，特异性相对较低，目前该激活剂还未能够应用到PC测定试剂盒中。

以上种种弊端使得PC检测难以在医院推广使用，从而限制了该检测项目的常规开展。因此，迫切需要开发一种新的PC激活剂用于PC活性测定试剂盒。

发明内容

本发明的目的在于提供一种蛋白C活性检测试剂盒，该试剂盒基于中国秦岭蝮蛇蛇毒激活剂，能有效定量检测血浆蛋白C活性，其检测特异性强；且原料易得、成本较低，适合批量化生产。

具体地，本发明提供了一种检测蛋白C活性的试剂盒，该试剂盒包括R1试剂和R2试剂；所述R1试剂包含一种蛋白C激活剂，所述蛋白C激活剂自中国秦岭蝮蛇蛇毒中提取，其SDS-PAGE电泳呈一条带，分子量在40-45KD之间；所述R2试剂为包含发色底物的试剂。

上述试剂盒中，所述蛋白C激活剂自中国秦岭蝮蛇蛇毒中提取的方法如下：