[发明专利]一种筛选辅酶依赖型氧化还原酶的方法

权利要求书

1.一种筛选辅酶依赖型氧化还原酶的方法，其特征在于包括以下步骤：

1）建立NAD(H)和NADP(H)依赖型氧化还原酶库；

2）对步骤1）中所述氧化还原酶，依据其反应条件进行分类；

3）对步骤2）中的每一类氧化还原酶通过实验统一其反应条件，建立对应的氧化还原酶系的检测平台；

4）建立菌株库；

5）利用检测平台对菌株库进行高通量酶活检测，筛选得NAD(H)和NADP(H)依赖型氧化还原酶。

2.如权利要求1所述的一种筛选辅酶依赖型氧化还原酶的方法，其特征在于在步骤2）和步骤3）中，所述反应条件包括反应温度、反应缓冲液、激活因子。

3.如权利要求1所述的一种筛选辅酶依赖型氧化还原酶的方法，其特征在于在步骤3）中，所述反应温度的统一采用以下方法：分别在不同测定温度下，考察多种酶的酶活情况，从而统一各酶的反应温度，所述不同测定温度的范围为0～100℃。

4.如权利要求1所述的一种筛选辅酶依赖型氧化还原酶的方法，其特征在于在步骤3）中，所述反应缓冲液的统一采用以下方法：考察各种缓冲液对多种酶检测的影响，从而统一各酶的反应缓冲液，所述缓冲液的pH范围为1～12，缓冲液的种类包括磷酸盐缓冲液、碳酸盐缓冲液、三羟甲基氨基甲烷-盐酸缓冲液、甘氨酸-氢氧化钠缓冲液。

5.如权利要求1所述的一种筛选辅酶依赖型氧化还原酶的方法，其特征在于在步骤3）中，所述激活因子的统一采用以下方法：通过考察各种金属离子在不同浓度下对各种酶检测的影响，从而统一各酶的激活因子，所述金属离子为钙、锰、锌、镁、钾、钠、铁、铝、锶、钡、铜、铅、锡、钴、镍。

6.如权利要求1所述的一种筛选辅酶依赖型氧化还原酶的方法，其特征在于在步骤3）中，所述建立对应的氧化还原酶系的检测平台的方法为：配制每个氧化还原酶系检测平台的反应母液，反应母液包含经统一后反应所需的缓冲液和激活因子。

7.如权利要求1所述的一种筛选辅酶依赖型氧化还原酶的方法，其特征在于在步骤4）中，所述菌株库中的菌株为分离自重金属污染的菌株，难降解有机物污染特殊生态环境的菌株，分离自深海、冰川、火山口极端环境的菌株，具高活力氧化还原酶潜力的菌株。

8.如权利要求1所述的一种筛选辅酶依赖型氧化还原酶的方法，其特征在于在步骤5）中，所述高通量酶活检测的具体方法如下：

（1）向微孔板中加入反应母液，所述微孔板包括12、48、96、384孔；

（2）分别向各微孔加入所测定各酶系的特异性底物；

（3）加入检测样品启动反应；

（4）使用酶标仪在340nm下利用初速度法检测样品中一类氧化还原酶的酶活力，酶活定义为在规定条件下，每分钟催化生成或者消耗1μmol NAD(P)H所耗酶量为1个酶活力单位，初速度法中所涉及酶活的计算公式为：

酶活力单位(U/mL)=(B_T×ΔA×K)/(ε×V_S×L)

其中V_T：反应液总体积；V_S：样品体积；ΔA：每分钟吸光度变化值；K：样品稀释倍数；ε：摩尔吸光系数(ε=6.22L/mmol/cm)；L：光程。