[发明专利]一种筛选辅酶依赖型氧化还原酶的方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种氧化还原酶，尤其是涉及一种筛选烟酰胺腺嘌呤二核苷酸（辅酶Ⅰ）和烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸（辅酶Ⅱ）依赖型氧化还原酶的方法。

背景技术

酶作为生物催化剂在工业上有着悠久的应用历史。因酶在催化反应中具有选择性高、条件温和等优点，使酶在有机合成等领域有很高的应用价值。如利用酶催化反应合成手性化合物，符合绿色化学的发展方向，具有广阔的应用前景。目前已知的酶有5536种，其中氧化还原酶有1513种，占27.3%（至2012年3月11日）。当氧化还原酶催化底物发生反应时需要电子供体或受体。生物体内众多的氧化还原酶在反应时，需要烟酰胺腺嘌呤二核苷酸（也称辅酶Ⅰ，简写为NAD(H)）或烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸（也称辅酶Ⅱ，简写为NADP(H)）以及黄素腺嘌呤二核苷酸或黄素单核苷酸等辅酶的参与。其中又以辅酶NAD(H)和NADP(H)依赖型氧化还原酶所占比例最大。

近年来，以氧化还原酶为基础的临床诊断、生物感应器、再生辅酶系统、手性化合物的生物合成以及污染物生物降解等技术都取得了令人瞩目的进展。氧化还原酶被用于不对称合成功能性类固醇、手性药物制剂、合成或修饰聚合物、氧化羟基及构建生物感应器等各个方面。其中NAD(H)和NADP(H)依赖型氧化还原酶在手性合成中有着重要的作用。如脱氢酶催化醛、酮、羰基以及烯烃碳碳双键的还原，使许多潜手性物质转化为手性产品应用于医药、食品、精细化工等领域。同时在催化还原硝基化合物、啤酒生产过程、农业废弃物等方面中研究氧化还原酶活性，给实际生产生活也带来巨大效益。

目前，筛选生物催化剂的手段主要包括从大量酶源中高通量筛选生物催化剂及宏基因组途径。对于氧化还原酶的筛选，已有报道（[1]Gilles Ravot,Denis Wahler,Olivier Favre-Bulle,et al.High Throughput Discovery of Alcohol Dehydrogenases for Industrial Biocatalysis[J].Advanced Synthesis and Catalysis,2003,345(6-7):691-694）利用宏基因组手段高通量挖掘乙醇脱氢酶。虽然分子克隆技术已足以完成宏基因组文库的构建及筛选，但是宏基因组在宿主细胞中不表达或表达量低、活性克隆子的频率极低等制约了它的实用性。相比较而言，从大量酶源中高通量筛选氧化还原酶是一条切实可行的发掘有实际应用价值的生物催化剂之路。在以往的生物催化剂高通量检测方法建立研究中，基本都是只着眼于某一种特定酶的高产菌株的高效筛选。而在每个细胞中往往含有上成千上万种酶，仅氧化还原酶就成百上千，这样导致在筛选过程中无法充分挖掘所考察菌株的实际应用价值，在人力、资源及时间成本上都造成了极大的浪费。因此发掘氧化还原酶宝库需要新的技术策略，迫切需要寻找一种简便、高效、经济的高通量技术与方法来筛选有重要工业应用价值的NAD(H)和NADP(H)依赖型氧化还原酶。

发明内容

本发明的目的在于提供一种效率较高、可增大发现有实际应用价值酶的概率，以克服现有的筛选手段实用性不高、资源浪费较大、效率较低等缺陷的筛选辅酶依赖型氧化还原酶的方法，所述辅酶依赖型氧化还原酶包括烟酰胺腺嘌呤二核苷酸（辅酶Ⅰ，记为NAD(H)）和烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸（辅酶Ⅱ，记为NADP(H)）依赖型氧化还原酶。

本发明包括以下步骤：

1）建立NAD(H)和NADP(H)依赖型氧化还原酶库；

2）对步骤1）中所述氧化还原酶，依据其反应条件进行分类；

3）对步骤2）中的每一类氧化还原酶通过实验统一其反应条件，建立对应的氧化还原酶系的检测平台；

4）建立菌株库；

5）利用检测平台对菌株库进行高通量酶活检测，筛选得NAD(H)和NADP(H)依赖型氧化还原酶。

在步骤1）中，所述NAD(H)和NADP(H)依赖型氧化还原酶库中的氧化还原酶可运用于临床诊断、生物感应器、再生辅酶系统、手性化合物的生物合成以及污染物生物降解等工业应用领域或可运用于代谢过程研究等生物科学研究领域。

在步骤2）中，所述反应条件包括反应温度、反应缓冲液、激活因子等。