[发明专利]一种基于PCR的甜瓜杂交种种子遗传纯度快速鉴定方法

说明书

技术领域

本发明属于生物技术领域，涉及一种基于PCR的甜瓜杂交种种子遗传纯度快速鉴定方法。

背景技术

甜瓜(Cucumis melo L.)属葫芦科一年生蔬菜。甜瓜杂交种在产量、品质、抗病性等方面具有较强的杂种优势，目前市场上对甜瓜杂交种的需求量逐年增加。多数甜瓜为雄全同株（雄花两性花同株）或雌雄同株异花植物（中国农业科学院郑州果树研究所等主编.中国西瓜甜瓜.北京：中国农业出版社，2000.2），在人工杂交制种过程中，常常由于母本去雄不及时，隔离不严或不彻底等原因，会导致甜瓜杂交种混有小部分母本自交或由其它来源不明花粉混杂所引起的‘假杂种’。另外，由于杂交种商业化程度较高，有少数的经营者对杂交种掺假导致种子遗传纯度下降，给生产者造成巨大的经济损失，严重损害了育种工作者与合法种子生产经营者的正当权益，同时也给种子供应单位带来极大的索赔风险。因此，在甜瓜杂交种子上市前，简便、快速、准确地鉴定其遗传纯度已成为育种工作者与种子生产经营者急需解决的难题。

目前，种子遗传纯度鉴定普遍采用的方法是田间形态学鉴定、同工酶鉴定，但田间鉴定方法费时费力，成本高，不能满足市场的要求，且易受季节限制和环境因素影响，准确性低。有时由于假杂交种与真杂交种形态学差异不明显，在苗期与成株期不易鉴别。同工酶分析易受环境和取材料部位的影响，特别对于一些亲本遗传差异较小的杂交品种，难以进行纯度检测与鉴定，准确度不高（柳李旺等，分子标记技术在蔬菜作物品种鉴定与纯度检测中的作用.分子植物育种,2004,2(4):563～568）。近年来，随着现代生物技术的不断发展，利用SSR（Simple Sequence Repeats，简单序列重复）、ISSR（Inter-Simple Sequence Repeats，简单序列重复间序列）、RAPD（Randomly Amplified Polymorphic DNA，随机扩增多态性DNA）等分子标记技术对杂交种进行遗传纯度鉴定已有相关报道，但大部分还是单独运用某一种分子标记来进行分析，准确度偏低（Pallavi,H.M.,et al.Identification of SSR markers for hybridity and seed genetic purity testing in sunflower(Helianthus annuus L.).Helia,2011(34):59-66）。利用SRAP(Sequence-Related Amplified Polymorphism,相关序列扩增多态性)、RAPD等多种分子标记同时对甜瓜F₁杂交种种子进行遗传纯度检测，可以有效克服形态学鉴定方法的缺点，不但快速简便，成本低、稳定可靠，而且不受生长阶段与环境影响，已成为甜瓜种子遗传纯度鉴定的重要检测方法之一。

‘海蜜2号’厚皮甜瓜是江苏省海门市农业科学研究所育成的海蜜系列甜瓜品种之一，具有产量高，品质优，风味独特，抗病性强等优点，适合于长江中下游多湿地区保护地春、秋两季栽培，该品种种植面积不断扩大（顾锡江,施建新,包卫红.海蜜2号厚皮甜瓜栽培技术规程及其研究与推广.中国西瓜甜瓜,2003(1):16～19）。

发明内容

本发明的目的是提供一种基于PCR的甜瓜杂交种种子遗传纯度快速鉴定方法。

本发明的目的可通过如下技术方案实现：

甜瓜杂交种‘海蜜2号’种子遗传纯度的鉴定方法，分别利用所筛选的SRAP引物组合NAUSRem6/NAUSRfc8和/或RAPD引物NAURP401，以提取的‘海蜜2号’甜瓜亲本与F₁单株基因组DNA为模板进行PCR扩增，应用非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳检测PCR扩增产物；只有同时具有亲本特异条带的单株才为真正的杂交种，缺少任一亲本条带均为假杂交种；所述的SRAP引物对NAUSRem6/NAUSRfc8的正向引物NAUSRem6序列为SEQ ID NO.1，反向引物NAUSRfc8序列为SEQ ID NO.2，该引物组合能够扩增出大小为350bp的母本特异条带，370bp的父本特异条带；所述的RAPD引物NAURP401序列为SEQ ID NO.3，产生大小为1270bp的母本特异条带，960bp的父本特异条带。

其中，SRAP标记PCR反应：