[发明专利]一种检测组氨酸标签重组蛋白的核酸适配体分子信标探针及其检测方法

说明书

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种检测组氨酸标签重组蛋白的核酸适配体分子信标探针及利用该探针进行组氨酸标签重组蛋白检测的方法。

背景技术

蛋白表达系统及其重组蛋白已被广泛应用于生命科学的各个学科研究，已经成为生物学有力的研究手段和工具。然而，从原生生物资源中分离和纯化重组蛋白的过程是非常复杂和耗时。为了简化这一过程，多种蛋白质亲和标签，如几丁质结合蛋白、麦芽糖结合蛋白、谷胱甘肽-S-转移酶和多聚组氨酸标签，被广泛用于重组蛋白分离和纯化。其中最常用的是在重组蛋白的N-或C-末端添加六个组氨酸残基的组氨酸标签。

与其它蛋白标签方法相比，组氨酸标签具有以下优点：1.分子量小，对目标蛋白功能、结构及活性的干扰作用较小，在后续应用中通常不需移除；2.表达方便，商品化含组氨酸标签的载体可在大肠杆菌、酵母、哺乳动物、昆虫和植物等不同表达系统中表达且纯化条件温和；3.无免疫原性，重组蛋白可以直接用来注射动物制备抗体，不影响免疫学分析；4.在高浓度尿素或胍等变性条件下，组氨酸标签仍保持结合能力。因此，目前组氨酸标签被广泛用于蛋白表达系统和蛋白质分析。

准确定量组氨酸标签重组蛋白将有助于表达载体和表达系统的评估及重组蛋白的应用。目前，检测组氨酸标签蛋白的探针主要有两类：抗组氨酸标签抗体和金属离子探针。但是这两类探针在应用上却受到了一定限制。组氨酸标签抗体抗体制备昂贵，检测时需要较长时间且缺乏准确定量能力。与抗体检测探针相比，金属离子探针价格低廉，但同样耗时和缺少准确定量能力。最重要的是，这两种方法都不能直接对细胞裂解物中组氨酸标签蛋白进行检测和定量分析。

核酸适配体是一种通过SELEX技术筛选获得的单链核酸。通过折叠成特定的空间三维结构，核酸适配体能高亲和性和高特异性的结合多种目标物，例如金属离子、有机小分子、多肽、蛋白质和细胞。另外，核酸适配体还具有制备简单、容易修饰和保存时间长等优点。因此核酸适配体被广泛应用于分析化学和生命科学等领域，如抗组氨酸标签核酸适配体6H5（5’-GGCTTCAGGTTGGTCTGGTTGGGTTTGGCTCCTGT GTACG-3’）被作为一种亲和探针检测与纯化组氨酸标记蛋白。

发明内容

本发明旨在克服现有技术中的不足，提供一种检测组氨酸标签重组蛋白的核酸适配体分子信标探针及利用该探针检测细胞裂解物中含组氨酸标签重组蛋白的直接通用方法。

为了达到上述目的，本发明提供的技术方案为：

所述检测组氨酸标签的核酸适配体分子信标探针包含SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示的序列；SEQ ID NO.1所示序列的3’端与SEQ ID NO.2所示序列的5’端通过PEG36桥联；SEQ ID NO.1所示序列5’端修饰有荧光素FAM；SEQ ID NO.2所示序列3’端修饰有淬灭基团Dabcy1。当所述探针未与组氨酸标记蛋白结合时，整个探针为茎环结构。在这结构中，探针中FAM基团的荧光信号被Dabcy1基团猝灭。当所述核酸适配体分子信标探针与含组氨酸标签重组蛋白结合时，探针的茎环结构改变，荧光基团FAM远离猝灭基团Dabcy1，使得FAM基团的荧光信号可以被检测到。

基于上述核酸适配体分子信标探针检测细胞裂解物中组氨酸标签重组蛋白的方法，包括如下步骤：

（1）制备核酸适配体分子信标探针：在ABI DNA synthersizer上合成所述的核酸适配体分子信标探针；

（2）将待测细胞裂解物加入到含有步骤（1）所述核酸适配体分子信标探针的缓冲溶液中，通过检测探针荧光强度的变化检测细胞裂解物中的含组氨酸标签的重组蛋白。

当溶液中没有含组氨酸标签的重组蛋白存在时，核酸适配体分子信标探针为茎环结构，此时FAM基团的荧光信号被Dabcy1基团猝灭；当溶液中存在可以与探针结合的组氨酸标签重组蛋白时，探针茎部会改变物理结构使得荧光基团FAM远离猝灭基团Dabcy1，进而使得荧光信号可以被检测到。

下面对本发明的探针及检测方法作进一步的说明：