[发明专利]用于生产己二酸的重组质粒、基因工程菌、其制备方法及用途

说明书

技术领域

本发明属于生物工程领域。本发明涉及一种用于生产己二酸的重组质粒和一种己二酸高产的基因工程菌。本申请还涉及所述重组质粒和基因工程菌的制备方法。本申请同时涉及所述重组质粒和基因工程菌用于基因工程发酵生产己二酸的生物产品中的用途以及使用本发明的基因工程菌发酵多种碳源生产己二酸的方法。

背景技术

当今世界能源问题成为世界经济发展的瓶颈，利用生物材料等可再生资源进行物质的生产成为当今科学研究的热点。

己二酸又名己烷二羧酸，是脂肪族二元酸中最有应用价值的二元酸，广泛应用于塑料、树脂、食品等领域，可用于制造尼龙、增塑剂、润滑脂、聚氨酰泡沫塑料，少量用于食品的增酸剂，以及医药、香料等方面的生产。

目前己二酸的生产工艺主要采取石油路线以环己醇及其混合物为原料的硝酸氧化法,该方法使用强氧化性的硝酸，设备腐蚀严重，而且产生的N₂O是引起全球变暖和臭氧减少的污染物之一，给环境造成了极大的污染。随着人们环保意识和可持续发展意识的提高，发酵法生产己二酸成了新的研究热点。一旦实现了己二酸发酵大规模生产，就可以取代石油化工产品苯及基于石油化工中间产品的多种商品，大大降低对环境的污染。己二酸发酵消耗1mol的葡萄糖，同时固定1mol的CO₂，消耗温室效应气体，因此发酵法产的己二酸将是一种绿色平台化学品。然而目前发酵法生产己二酸的难度大，底物转化率低，成本偏高，因此，迫切需要寻找或构建能代谢多种廉价碳源，发酵条件简单，己二酸高产的新菌株。

与乳酸、乙醇等有机物的发酵研究相比，己二酸的发酵研究起步较晚，。综合已有文献来看，菌种研究方面，比较有应用前景的包括能够降解己二酸的产黄青霉菌、经基因改造的假单胞菌和经基因改造的大肠杆菌。其中大肠杆菌的培养条件简单，菌种本身有己二酸代谢途径，具有代谢灵活性，易于基因工程改造。对大肠杆菌己二酸代谢的研究表明，在以葡萄糖为底物的混合酸的发酵中，己二酸生成过程如下：（1）通过丁二酸合成途径，合成丁二酸，并在由葡萄糖发酵生成丁二酸的过程中固定了CO2；（2）在乙酰辅酶A转移酶（paaJ）作用下由丁二酸生成六碳化合物3-羰基-己二酰辅酶A(3-Oxoadipyl-CoA)；（3）3-羰基-己二酰辅酶A在羟酰脱氢酶的作用下生成3-羟基-己酰辅酶A；（4）3-羟基-己酰辅酶A脱水酶脱水形成5-羧基-2-戊烯基辅酶A；（5）5-羧基-2-戊烯基辅酶A还原酶生成己二酰辅酶A；（6）己二酰辅酶A在水解酶的作用下水解为己二酸。

目前国内外对大肠杆菌生产己二酸的代谢网络途径改造有两种：1、表达异源的Klebsiella pneumoniae aroZ酶、aroY酶和Acinetobacter calcoaceticus catA酶；2、过量表达大肠杆菌的paaJ酶、paaH酶、maoC酶、sucCD酶、异源的Clostridium acetobutylicum bcd酶、etfA酶和etfB酶。（Journal of the American Chemical Society，1994，116（1）：399；美国专利第US2010/0330626号）第一种改造的出发点是将由葡萄代谢产生粘糠酸途径的三个酶在大肠杆菌进行异源表达；第二种改造的出发点是在大肠杆菌内过量表达经3-羟基-己酰辅酶A产己二酸代谢途径的所有酶。第一种改造的缺陷是生成的粘糠酸需要经过进一步的化学催化才能生成己二酸。第二种改造的缺陷是大肠杆菌本身产生的丁二酸的量很低，仅仅过量表达由丁二酸开始的下游基因，对己二酸的最终产量影响不大。

在发明人已经获得授权的专利ZL200710121399.9中，通过将蓝藻鱼腥藻碳酸酐酶经由基因重组转入大肠杆菌对大肠杆菌的丁二酸代谢途径进行了改造，成功获得了丁二酸高产的大肠杆菌基因工程菌。这为在此基础上对大肠杆菌的己二酸代谢途径进行改造并获得己二酸高产的大肠杆菌基因工程菌提供了良好的技术基础。

发明内容

为了充分利用大肠杆菌本身具有的己二酸代谢途径，同时去除不利的代谢途径，并且发挥外源基因提高二氧化碳利用率的作用，本发明将蓝藻鱼腥藻（Cyanobacterium anabaena）碳酸酐酶（CA）基因和大肠杆菌（Escherichia coli）乙酰辅酶A转移酶paaJ基因同时转入不含有丙酮酸甲酸裂解酶（Pf1酶）基因的大肠杆菌中，从而提高大肠杆菌生产己二酸的产量。