[发明专利]一种生物反应器大规模培养的方法

权利要求书

1. 一种生物反应器大规模培养的方法,其步骤是:

（1）重组H5N1禽流感病毒在MDCK细胞上适应，所述的病毒36.5-37.5℃吸附1－2小时，去除病毒液，病毒稀释液清洗MDCK细胞2－4次后更换细胞维持液，取血凝效价>2⁴病毒稀释倍数的病毒液或者致细胞产生病变的稀释倍数病毒作为种子病毒继续适应；病毒在5代以内适应MDCK细胞，病毒血凝效价>2⁷；

（2）步骤1适应病毒株作为反应器大规模培养病毒种子批制备，所述的种子批病毒代次≥F6；血凝效价≥2⁸；EID50≥10^7.5，所述病毒稀释液为含TPCK-胰酶1.0-1.5ug/ml的高糖DMEM；病毒维持液为含TPCK-胰酶0.5-1ug/ml高糖DMEM；

（3）以聚酯片为载体培养MDCK细胞，所述的以聚酯片为载体，反应器为篮式固定床，30-50g /L载体投放量，每克载体投放0.5-4.5*10⁷个细胞；培养基为含8-10％新生牛血清DMEM；细胞20分钟内贴壁，阶段搅拌转速45r/min ，DO为60％，温度为36－38℃，Ph为7.0-7.3，通气量为0.1SLPM；细胞培养阶段依据细胞耗氧，搅拌转速控制50-120r/ml，通气量0.1-0.5 SLPM，Ph7.2，反应器中糖浓度1.8-2.2g/L，调整灌流速度为5-40ml/min；细胞培养50-70小时生长至平台期，平均每200g载体上的细胞糖耗为1.7-2.5g/h；

（4）步骤3培养的MDCK细胞接种病毒，所述的反应器培养MDCK细胞接种病毒时，PBS清洗细胞2－4次，病毒稀释液清洗细胞1－2次，病毒接种MOI为0.01-0.00001；病毒吸附过程中TPCK-胰酶浓度1.0-1.5ug/ml，温度36.5-37.5℃，搅拌转速40-60r/min，DO为60％，Ph为7.6，病毒吸附2小时；病毒培养阶段细胞维持和病毒培养温度为33-35℃，搅拌转速60-120r/min，通气量为0.2--0.6SLPM，4-6小时后更换细胞维持液；

（5）MDCK细胞维持和病毒增殖，所述的步骤5病毒培养阶段细胞维持和病毒培养温度为33-35℃，搅拌转速60-120r/min，通气量为0.2--0.6SLPM，4-6小时后更换细胞维持液；灌流培养速度为10-50ml/min，糖浓度保持2.0-2.8g/L，所述病毒稀释液为含TPCK-胰酶1.0-1.5ug/ml的高糖DMEM；病毒维持液为含TPCK-胰酶0.5-1ug/ml高糖DMEM；

（6）监测血凝效价收获病毒，所述的病毒血凝效价最高为2¹¹，收获7.5-9个反应器培养体积病毒液，其中4.5-5个反应器培养体积病毒液血凝效价大于2⁹；另外3-4个反应器培养体积病毒液血凝效价2^7-8。