[发明专利]一种生物反应器大规模培养的方法

说明书

技术领域

本发明属于兽医生物技术领域，更具体涉及一种重组H5N1禽流感病毒5代以内快速适应MDCK细胞培养的方法，适应病毒株在生物反应器大规模培养。 

技术背景

H5N1高致病性禽流感病毒(Highly pathogenic avian influenza virus，HP-AIV)在世界范围内广泛存在，不仅可以感染禽类，而且可以跨越种间屏障感染多种哺乳动物，尤其是可以直接感染人，并导致死亡，严重的危害了养禽业和人类的健康，因此禽流感的防制是非常重要的。全群扑杀和生物安全防护是及时扑灭和控制高致病性禽流感(HPAI)的主要措施，而疫苗接种是防控禽流感最有效和最经济的方法。 

过去50年来，一直通过鸡胚培养生产流感疫苗。由于流感疫苗的生产需要使用大量鸡胚，且生产周期长，易污染，不易于控制，生产效率较低。自从1996年以来，哺乳动物细胞已经发展到能够自由扩大培养并且用于工业化生产，而禽流感疫苗也可以通过动物细胞大规模培养制备。生物反应器能够有效地增加单位体积细胞培养的密度，从而为病毒性疫苗大规模生产奠定坚实的基础。 

目前我国禽流感H5N1商品疫苗主要是通过流感病毒反向遗传学操作技术构建的重组疫苗株。但是以MDCK细胞增殖重组H5N1禽流感疫苗株存在很多困难：1、病毒从鸡胚到细胞两种不同的培养基质转换需要适应过程；2、因转瓶培养细胞量的限制，H5N1禽流感病毒HA效价不会高于2⁹，不能满足疫苗制备的要求；3、重组H5N1禽流感病毒HA自切割位点一般被去除，在病毒的吸附过程中必须更换添加TPCK-胰酶的无血清培养基，其工艺复杂。因此，研发新的生产工艺，使H5亚型禽流感病毒快速在MDCK细胞上适应，从方瓶、转瓶快速放大到操作简单的固定床篮式搅拌系统生物反应器，大规模生产重组H5亚型禽流感病毒是非常必要的。 

中国专利号02112013.7的发明专利说明书公开了一种利用Fibra-CeTMDisks为载体大规模连续生产病毒疫苗的方法，虽然该工艺适合于狂犬疫苗、出血热、乙脑、小儿脊髓灰质炎病毒，但是却不适合需要传代适应的流感病毒。中国专利号201010596058.9的发明专利说明书公开了利用Cytodex1为载体在生物反应器培养MDCK细胞增殖H9N2型禽流感病毒。 中国专利号201010159741.6的发明专利说明书公开了生物反应器培养MDCK细胞全悬浮培养工艺，以及增殖H9N2病毒制备疫苗的工艺。中国专利号201010282155.0的发明专利说明书公开了利用Cytodex1为载体在生物反应器培养MDCK或者细胞增殖工业化生产动物流感病毒。 

以上文献资料都有不同程度的涉及禽流感病毒的生产工艺方法。但是，对重组H5N1禽流病毒在MDCK细胞的快速适应以及利用聚酯片为载体在固定床篮式搅拌系统反应器的生产工艺并未涉及。 

发明内容

本发明目的是在于提供了一种生物反应器大规模培养的方法，方法易行，操作简便，适应后病毒HA效价>2⁷；该病毒从方瓶、转瓶培养工艺快速转换到操作简单的固定床篮式搅拌系统反应器的大规模培养，其HA效价可以达到2¹¹，解决了目前重组H5N1禽流感病毒在MDCK细胞上培养病毒滴度不能满足疫苗生产的难题。 

为了实现上述的目的,本发明采用以下技术方案： 

一种生物反应器大规模培养的方法（一种重组H5N1型禽流感病毒在MDCK细胞上的快速适应方法和该适应病毒的生物反应器大规模培养工艺）,其步骤是: 

（1）重组H5N1禽流感病毒在MDCK细胞（见遗传资源表）上的快速适应，所述的步骤（1）病毒36.5-37.5℃吸附1－2小时，去除病毒液，病毒稀释液清洗MDCK细胞2－4次后更换细胞维持液，取血凝效价>24且病毒稀释倍数最高的病毒液或者致细胞最晚产生病变的最高稀释倍数病毒作为种子病毒继续适应；病毒在5代以内适应MDCK细胞，且病毒血凝效价>2⁷。 

（2）经过步骤（1）适应MDCK细胞内增殖的重组H5亚型禽流感病毒作为反应器大规模培养的种子病毒，所述的步骤（2）种子病毒代次≥F6；血凝效价≥2⁸；EID50≥10^7.5。所述病毒稀释液为含TPCK-胰酶1.0-1.5ug/ml的高糖DMEM；病毒维持液为含TPCK-胰酶0.5-1ug/ml高糖DMEM。