[发明专利]一种分析白酒发酵体系中Bacillus群落结构的方法

权利要求书

1.用变性梯度凝胶电泳定性并半定量分析白酒发酵体系中Bacillus群落结构的方法，其特征在于包括以下步骤：

（a）选择实验的大曲或酒醅样品，对样品进行预处理，并用珠磨法提取样品中微生物的总基因组DNA；

（b）选择Bacillus的16S rRNA V9区基因作为DGGE的靶基因设计两对引物，并在第二轮PCR的正向引物的5’端加上GC发夹结构；

巢式PCR所用的第一轮Bacillus专一性引物为：

p1-F：5’-CGATGCGTAGCCGACCTGAG-3’，

p1-R：5’-AAGGAGGTGATCCAGCCGCA-3’；

第二轮针对Bacillus 16S rDNA V9区的引物为：

p2-F：5’-ATGGCTGTCGTCAGCT-3’，

p2-R：5’-CGCCCGCCGC GCGGCGGGCG GGGCGGGGGC ACGGGCGGTG TGTAC-3’；

（c）以步骤（a）中的基因组为模板进行PCR扩增；

（d）将PCR产物在最适条件下进行DGGE电泳分析；

（e）染色后与已知的Maker比对，确定具有相同电泳迁移率的DNA条带相应的种属，将未知的优势条带切胶回收；

（f）回收的DNA条带重新PCR扩增、连接T载体，转化入大肠杆菌感受态细胞，涂布于加有一定浓度Amp的LB平板，挑选阳性克隆子；

（g）对阳性克隆子的菌落PCR产物，再次进行DGGE比对、验证；

（h）将与回收DNA条带具有相同电泳迁移率的PCR产物进行测序，测序结果在GenBank数据库中blast比对分析；

（i）采用quantity one软件将DGGE图谱条带亮度进行数字化处理，即将每条条带的亮度转化为峰面积，将所有条带的峰面积加和代表Bacillus菌群总数，某种Bacillus相应的DNA条带的峰面积在所有条带峰面积之中所占比重，即为这种Bacillus在总的Bacillus菌群中所占的比例。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于其中步骤（a）中的样品可为任意香型、地区采集的中国白酒大曲或酒醅样品，样品多点取样、混合后进行预处理。

3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于其中步骤（d）中电泳仪器为Dcode基因突变检测系统，电泳条件为电压100V，60℃下电泳200min，变性梯度为33%-43%。

4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于其中步骤（e）中染色方法为使用SYBR green染色三次，每次15min；未知条带切胶回收的方法为：优势条带切割后置于灭过菌的1.5mL离心管中，加入适量灭菌超纯水清洗，然后加入60μL灭菌超纯水并于4℃冰箱静置过夜。

5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于其中步骤（f）中PCR扩增采用的引物与步骤（b）中的引物相同。

6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于其中步骤（g）中菌落PCR的引物与与步骤（b）中的引物相同，并且是将阳性克隆子菌落PCR产物与步骤（c）中的样品PCR产物进行重新DGGE电泳比对。