[发明专利]一种分析白酒发酵体系中Bacillus群落结构的方法

说明书

技术领域

一种分析白酒发酵体系中Bacillus群落结构的方法，本发明涉及使用现代分子生物学技术—聚合酶链式反应-变形梯度凝胶电泳（PCR-DGGE）克服传统微生物分离方法的缺陷，定性并半定量分析中国白酒群体微生物的发酵体系中Bacillus群体的结构组成及其动态演变规律，属于微生物生态技术领域。 

背景技术

中国白酒生产是一个开放的固态发酵过程，可以说白酒的生产实际上包含了一个庞大的微生物区系的复杂代谢过程，受环境的影响较大。随着环境条件的改变，微生物区系也会发生改变，并对白酒的风味口感产生影响。大曲和酒醅是白酒生产中重要的微生物载体，其中Bacillus是主要的细菌。大部分Bacillus属的菌种都能合成淀粉酶、蛋白酶，且对白酒生产中的不利环境条件具有较高的抵抗力，自始至终存在于白酒酿造过程中。因此，Bacillus是白酒发酵体系中重要的产酶菌和生香细菌，Bacillus群体的结构成为中国白酒研究的热点。 

目前国内学者主要通过筛选、培养方法来分离、分析白酒发酵体系中的Bacillus。从白酒发酵体系中分离得到的Bacillus主要有枯草芽孢杆菌（Bacilus subtilis）、环状芽孢杆菌（Bacillus circulans）、巨大芽孢杆菌（Bacillus magaterium）、蜡状芽孢杆菌（Bacillus cereus）、地衣芽孢杆菌（Bacillus licheniformis）和解淀粉芽孢杆菌（Bacillus amyloliquefaciens）等。有研究学者发现在酱香型白酒发酵过程中，某些B.licheniformis是产生酱香风味的重要功能微生物，还发现某些Bacillus是酱香型高温大曲中生成酸性蛋白酶的主要菌种。而B.subtilis在大曲细菌中数量较多，是形成酒体芳香类物质的重要菌源。白酒酿造体系中形成了特殊结构和特殊功能的Bacillus群体。 

但传统的微生物研究方法具有较大的局限性，存在操作繁琐，菌落形态、生化特性相像导致难以准确鉴定，结果准确性及可靠性差，易遗漏某些培养条件苛刻的Bacillus菌种等缺点。近年来，系统生物学提出了一个观点，即复杂体系中群体微生物的组成及比例都会影响体系的功能。由于分离培养方法会改变原始菌群的构成，无法分析微生物之间以及微生物与环境之间的相互关系，所以不适于白酒酿造过程的实时监测。分子生态学方法在白酒的研究中开始得到应用。 

DGGE技术是由Fisher和Lerman在1979年率先提出的用于检测DNA突变的一种电泳技术，其基本原理是由于双链DNA在一般的聚丙烯酰胺凝胶电泳时，不同长度的DNA片段能够被区分开来（迁移行为决定于其分子大小和电荷），但同样长度的DNA片段因在胶中迁移行为一样而无法区分开来。因此在一般的聚丙烯酰胺凝胶基础上，加入了变性剂(尿素和甲酰胺)梯度，不同序列的DNA片段在各自相应的变性剂浓度下解链，发生空间构型的变化，导致电泳速度的急剧下降，最后停滞在其相应的变性剂梯度位置，从而能够把同样长度但序列不同的DNA片段区分开来。DGGE由于能有效分析复杂体系中微生物群落结构组成，而越来越受到重视。如今，由于DGGE具有能检测到难以培养或不能培养的微生物、检测速度快、重现性强、结果准确可靠、方便易操作等优点，被广泛应用于多个微生态系统领域的研究中，包括土壤、海洋湖泊、人体和动物肠道、发酵食品等等，是研究复杂体系中微生物群落结构组成以及菌群多样性动态变化分析主要的分子生物学方法之一。 

由于PCR扩增的偏好性，用细菌16S rDNA V3区的通用引物分析白酒大曲和酒醅，往往会低估Bacillus的多样性。为针对研究Bacillus的群体结构，用选择16S rDNA V9区基因作为DGGE的靶基因。为降低PCR扩增的偏好性、提高扩增的特异性，采用巢式PCR获得特异性片段。巢式PCR基本原理是利用两套PCR引物对进行两轮PCR扩增反应。在第一轮扩增中，第一对引物（外引物）用以产生扩增产物。第二对引物称为巢式引物，它们结合在第一次PCR产物的内部，使第二次PCR扩增片段短于第一次扩增。由于巢式PCR有两次PCR扩增，从而降低了扩增多个靶位点的可能性，因而巢式PCR特异性强、准确度高、可靠性高。