[发明专利]一种ɑ-1，3半乳糖基转移酶融合蛋白及制备方法

说明书

技术领域

本发明属于生物领域，涉及一种糖基转移酶，具体涉及一种α-1，3半乳糖基转移酶融合蛋白，其催化α-半乳糖表位的形成。 

背景技术

α-1，3半乳糖基转移酶存在于一些动物如牛，鼠等体内，人类不具备此酶。该酶在特定的底物上形成α-1，3半乳糖基后成为一种能被人体内天然存在的抗体所识别的表位，此表位通常称为α-半乳糖表位；这是人类异体移植产生免疫排斥反应的生物学基础，因此，α-1，3半乳糖基转移酶可用于合成抗免疫排斥反应的药物。 

后来研究发现，经过该酶修饰处理后的人体肿瘤细胞等能更有效地被自身免疫系统所识别，进而更有效地被清除，这种修饰的细胞或细胞碎片因此被称为自体疫苗。 

基于上述原因，提供大量并有活性的α-1，3半乳糖基转移酶具商业意义。到目前为止，α-1，3半乳糖基转移酶在细菌中表达均形成包涵体，或绝大部分形成包涵体，即不可溶的非活性的状态。虽然利用蛋白质的复性及变性方法可以改变蛋白质的不可溶的非活性的状态，但其费时费力，效果差且污染环境。 

发明内容

本发明要解决的技术问题为不采用蛋白质的复性及变性技术方案而实现α-1，3半乳糖基转移酶在细菌中具生物活性的可溶性表达。 

本发明的一个目的是提供一种融合蛋白，由TRX蛋白与α-1，3半乳糖基转移酶融合形成，具有催化α-半乳糖表位形成活性。 

硫氧还蛋白(thioredoxin,Trx)是一种具有氧化还原活性的小分子蛋白质,分子质量12kD,广泛存在于所有生物体中。作为机体内一种重 要的氧化还原调节蛋白，硫氧还蛋白（TRX）具有多种生物学功能。TRX是非常有效的自由基清除剂，能保护细胞免受诸如肿瘤坏死因子(TNF)以及H₂O₂等引起的氧化损伤。此外，TRX还通过修复受损伤的蛋白、抑制凋亡和调节某些转录因子表达对细胞起保护作用。目前研究证实TRX在组织的缺血再灌注损伤和神经退行性病变的防治中发挥了重要作用。 

在实现上述技术方案过程中，具体的实验设计和实施方式可以是在本技术领域的技术人员所公知的知识和方法范围内作任何等同的替代或变换或改变，并不限于该申请文件所具体陈述的范围。例如，α-1，3半乳糖基转移酶基因，除了通常用全长基因外，还可以用其功能域。我们已用了一种功能域，当然还有其他氨基酸多一些或少一些的功能域，只要功能域保持催化α-半乳糖表位形成的功能（催化结构功能）即可。类似等同的替代或变换或改变，在此不一一列举。 

作为优选，所述α-1，3半乳糖基转移酶包括其催化结构功能域α1,3GTcd部分。 

更优选地，所述α-1，3半乳糖基转移酶还包括用于纯化的序列。 

为了进一步简化α-1，3半乳糖基转移酶融合蛋白的纯化，本发明所述融合蛋白还可以包含任何本技术领域的技术人员所已知的例如GST或His-tag等蛋白或结构功能域。在本发明的具体实施例中，α-1，3半乳糖基转移酶的上游设计选择了His-tag以便后续纯化之用，当然His-tag也可设计在整个融合蛋白的上游或下游，或者使用其他纯化功能的蛋白序列。 

本发明所述的融合蛋白，其为可溶状态。 

在本发明的具体实施方式中，提供的融合蛋白氨基酸序列如SEQ ID No.3所示。 

本发明为了避免包涵体的形成，直接在细菌中产生可溶性的具有酶学活性的蛋白，采取了如下技术方案： 

克隆α-1，3半乳糖基转移酶基因，把该基因直接克隆到常用的表达载体上，结果形成了包涵体；更改不同的载体或者更改不同的受体 菌仍然形成包涵体；接着，借助于蛋白融合技术，把该基因与TRX基因，即一种氧化还原蛋白thioredoxin基因融合在一起，使α-1，3半乳糖基转移酶以融合蛋白的形式进行表达，结果该融合蛋白在通常的各种培养条件下均形成可溶性表达，并且重要的是：该融合蛋白完全具有α-1，3半乳糖基转移酶活性。另外，本发明所述融合蛋白的表达量较高，占可溶性细菌裂解物的20%以上。 

本发明还提供产生根据所述α-1，3半乳糖基转移酶融合蛋白的细菌。作为优选，其为大肠杆菌DH5α或大肠杆菌BL21（DE3）。 

本发明的又一个目的是提供一种生产所述α-1，3半乳糖基转移酶融合蛋白的方法。