[发明专利]肠出血性大肠杆菌O157:H7多价fliC-hcpA-tir-eae重组菌及疫苗

权利要求书

1.肠出血性大肠杆菌O157:H7多价融合型重组菌，其构建方法为：

根据GenBank中O157:H7 EDL933 的fliC、hcpA、tir和eae基因序列分别设计引物，并分别在上下游引物两端加入酶切位点，在hcpA基因后和eae基因前分别加入长度为24个核苷酸的连接片段，引物序列如下：

fliC-P1：5-ggggagctcactattaccaacaaa-3                  Sac Ⅰ

fliC-P2：5-ttactcgagggtcgttgcagaacc-3                  Xhol Ⅰ

hcpA-P1：5-gggctcgagtttacacttatcgaactgat-3              Xhol Ⅰ

hcpA-P2：5-tttgaattctttagcagcagctttagcagcagcgttggcgtcatc-3  EcoRⅠ

tir-P1： 5-gatgaattcgagccggatagccca-3                   EcoRⅠ

tir-P2： 5-ttagtcgacagcccccgatgaaac-3                   Sal Ⅰ

eae-P1：5-ttagtcgacgctgctgctaaagctgctgctaaatttgatcaaacc-3   Sal Ⅰ

eae-P2：5- ggctctagattattctacacaaaccgc-3                 Xba Ⅰ

O157:H7过夜培养物，1mL/管，12000r离心2分钟，弃上清，收集菌体重悬于1/5体积双蒸水，煮10min，4℃12000r离心10分钟，吸取上清冻存-20℃，用于PCR扩增用；

扩增fliC片段的上下游引物分别加有SacⅠ和XholⅠ酶切位点，扩增eae片段的上下游引物分别加有SalⅠ和XbaⅠ酶切位点，PCR反应条件均为：95℃预变性5分钟，94℃ 1分钟，55℃ 30秒，72℃ 1分钟，30个循环，72℃再延伸10分钟；扩增hcpA片段的上下游分别引物加有XholⅠ和EcoRⅠ酶切位点，扩增tir片段的上下游引物分别加有EcoRⅠ和SalⅠ酶切位点，PCR反应条件均为：95℃预变性5分钟，94℃ 1分钟，56℃ 30秒，72℃ 30秒，30个循环，72℃再延伸6分钟；

fliC-P1和 fliC-P2、hcpA-P1和hcpA-P2、tir-P1和tir-P2、eae-P1和eae-P2扩增片段长度分别为946bp、423bp、309bp和811bp； 

将扩增的PCR产物用质量比1.2%的琼脂糖电泳，切胶称重，加入3倍体积DE-A 缓冲液后65℃作用10分钟，待胶全部融化后，再加入DE-A 缓冲液的0.5体积的DE-B 缓冲液，颠倒混匀后，将融化的液体转移于微型柱子，并12000g离心1分钟，弃液体，加入洗涤缓冲液Ⅰ500uL，12000g离心30秒，再弃液体，加入洗涤缓冲液Ⅱ750uL，12000g离心1分钟，弃液体，空管12000g离心1分钟，转移柱子于干净的1.5mL离心管中，并加入60uL 洗脱缓冲液，12000g离心1分钟，收集离心液，即为经过纯化的fliC、hcpA、tir和eae片段；

将SacⅠ和XholⅠ酶切的fliC片段4uL与同样酶切的载体pColdⅠ片段4uL，T4 DNA连接缓冲液和T4 DNA连接酶各1.0uL，同时加入一个离心管，混匀后，4℃连接过夜，用于转化Top10感受态细胞，挑取单个菌落进行过夜培养，提取质粒，用SacⅠ和XholⅠ双酶切，37℃水浴2小时，琼脂糖凝胶电泳，可以看到 fliC片段大小的条带出现，获得pColdⅠ-fliC重组质粒；用XhoⅠ和EcoRⅠ酶切hcpA片段和pColdⅠ-fliC重组质粒，胶回收后，pColdⅠ-fliC取4.0uL，hcpA片段取2 uL，T4 DNA连接缓冲液和T4 DNA连接酶各1.0ul，补水2 uL，一同加入eppendorf管，混匀后，4℃连接过夜，转化Top10感受态细胞，挑取单个菌落进行过夜培养，提取质粒，酶切，37℃水浴2小时，琼脂糖凝胶电泳，可以看到hcpA片段大小的条带出现，获得pColdⅠ-fliC-hcpA重组质粒；用EcoRⅠ和SalⅠ酶切tir片段和pColdⅠ-fliC-hcpA重组质粒，胶回收后，pColdⅠ-fliC-hcpA取2.0uL，tir片段取3.0 uL，T4 DNA连接缓冲液和T4 DNA连接酶各1.0uL，补水3 uL，一同加入离心管中，4℃连接过夜，转化Top10感受态细胞，挑取单个菌落进行过夜培养，提取质粒，酶切，37℃水浴2小时，琼脂糖凝胶电泳，可以看到tir片段大小的条带出现，获得pColdⅠ-fliC-hcpA-tir重组质粒；用SalⅠ和Xba Ⅰ酶切eae片段和pColdⅠ-fliC-hcpA-tir重组质粒，胶回收后，pColdⅠ-fliC-hcpA-tir和eae各取4.0uL，T4 DNA连接缓冲液和T4 DNA连接酶各1.0ul，一同加入管中，混匀后，4℃连接过夜，转化Top10感受态细胞，挑取单个菌落进行过夜培养，提取质粒，酶切，37℃水浴2小时，琼脂糖凝胶电泳，可以看到eae片段大小的条带出现，获得pColdⅠ-fliC-hcpA-tir-eae重组质粒，将测序正确的阳性质粒pColdⅠ-fliC-hcpA-tir-eae转化到BL21（DE3）感受态细胞中，获得多价重组菌BL21（pColdⅠ-fliC-hcpA-tir-eae）。