[发明专利]肠出血性大肠杆菌O157:H7多价fliC-hcpA-tir-eae重组菌及疫苗

说明书

一、技术领域

本发明涉及肠出血性大肠杆菌O157:H7多价融合型重组菌、重组蛋白制备方法及亚单位疫苗，属于生物制药领域。

二、背景技术

肠出血性大肠杆菌（enterohaemorrhagic Escherichia coli，EHEC）是重要的食源性人兽共患病原，O157:H7是其重要的血清型。近20余年来，EHEC O157:H7引发的食物中毒在世界各地包括中国都有不同规模的暴发流行。EHEC O157:H7感染患者和无症状携带者可作为传染源。在动物宿主范围非常广泛，其中反刍动物带菌率较高。相对来讲，动物作为传染源要比人类更为重要，它往往是动物源食品污染的根源。

人类感染可引起严重的胃肠道和循环系统疾病，如出血性结肠炎（hemorrhagic Colitis，HC）、溶血尿毒综合征（Haemolytic uraemic syndrome，HUS）等，个别患者可因急性和慢性肾功能衰竭而死亡。动物感染一般不引发明显的临床症状，但能够长期甚至终生携带。EHEC动物宿主范围非常广泛，其中反刍动物带菌率较高。因此，防控EHEC O157:H7的重中之重是减少和控制动物带菌和排菌。

目前，对O157:H7的感染缺乏有效的防治方法，只能给予对症治疗和适当的抗菌治疗。由于O157:H7的暴发流行特点和治疗上的困难，疫苗研究就显得极为紧迫。有效的疫苗研制是预防和治疗O157:H7感染最简单、经济和快捷的手段。

选取与EHEC O157:H7粘附和定植密切相关的鞭毛（H7）、菌毛（HCP）和紧密素（Intimin）和转位紧密素受体（Tir）四个基因分别设计特异性引物对，扩增相应基因片段，并依次串联，构建重组菌，获得重组蛋白，制备亚单位疫苗，用于预防EHEC O157:H7在动物体内的定植。

三、发现内容

技术问题  本发明目的在于构建EHEC O157:H7多价融合型重组菌，表达重组蛋白，进而研制亚单位疫苗。本发明在抗原选择上直接针对EHEC O157:H7重要的粘附因子，强调多个粘附因子的联合应用以产生最大的免疫保护作用，降低动物带菌率，进而减少人类感染EHEC的机会，保障人类身心健康。

技术方案  本发明的具体实施方案如下：

肠出血性大肠杆菌O157:H7（EHEC O157:H7）多价融合型重组菌、重组蛋白制备方法及亚单位疫苗，其特征在于，所说的多价重组菌和重组蛋白为BL21（pColdⅠ-fliC-hcpA-tir-eae）。多价重组菌和重组蛋白的制备方法包括：

（1）肠出血性大肠杆菌O157:H7免疫多价融合型重组菌，其构建方法为：

根据GenBank中O157:H7 EDL933 的fliC、hcpA、tir和eae基因序列分别设计引物，并分别在上下游引物两端加入酶切位点（下划线部分），在hcpA基因后和eae基因前分别加入长度为24个核苷酸的连接片段，引物序列如下：

fliC-P1：5-ggggagctcactattaccaacaaa-3                  Sac Ⅰ

fliC-P2：5-ttactcgagggtcgttgcagaacc-3                  Xhol Ⅰ

hcpA-P1：5-gggctcgagtttacacttatcgaactgat-3              Xhol Ⅰ

hcpA-P2：5-tttgaattctttagcagcagctttagcagcagcgttggcgtcatc-3  EcoRⅠ

tir-P1： 5-gatgaattcgagccggatagccca-3                   EcoRⅠ

tir-P2： 5-ttagtcgacagcccccgatgaaac-3                   Sal Ⅰ