[发明专利]一种获得红豆杉转基因愈伤组织的遗传转化方法

权利要求书

1.一种获得红豆杉转基因愈伤组织的遗传转化方法，其特征在于利用红豆杉下胚轴作为外植体诱导愈伤组织，并经过培养获得胚性愈伤，用根癌农杆菌介导，将带有GUS基因的pCAMBIA1304质粒导入红豆杉愈伤组织，PCR检测外源潮霉素磷酸转移酶基因的整合情况，用组织化学方法检测GUS基因在组织中的表达情况，获得红豆杉的转基因愈伤组织；具体步骤为：

(1) 红豆杉愈伤组织的诱导培养：选择下胚轴为愈伤组织诱导用外植体，在愈伤组织诱导培养基上进行暗培养，在下胚轴两端逐渐产生白色的愈伤组织，并且不断膨大；上述愈伤组织诱导培养基是以B5培养基为基础，再添加激素NAA、TDZ和2,4-D而组成；

(2) 红豆杉胚性愈伤组织的诱导培养：将下胚轴诱导出的白色愈伤转接入胚性愈伤诱导培养基上，预防水样化和褐化，并获得致密的、硬度增加的胚性愈伤组织；该胚性愈伤诱导培养基是以B5培养基为基础，再添加5种氨基酸和激素2,4-D、NAA和TDZ 而组成；

(3) 遗传转化：利用根癌农杆菌介导法，将含GUS基因的植物表达载体pCAMBIA1304根癌农杆菌，以红豆杉胚性愈伤组织为受体进行遗传转化；

(4) 抗性胚性愈伤组织的脱菌、筛选和增殖培养：经过遗传转化，然后在恢复培养基上进行脱菌培养，在筛选培养基上进行筛选培养，获得具有潮霉素抗性的愈伤组织；将抗性愈伤组织接入胚性愈伤组织继代培养基进行增殖培养，增加抗性愈伤组织的数量；

(5) PCR检测和GUS组织化学染色方法检测转基因愈伤：PCR检测pCAMBIA1304质粒上带有的潮霉素磷酸转移酶基因；GUS组织化学染色，将愈伤组织浸入配制好的GUS染色液中，37℃染色过夜，愈伤组织中的蓝色为报告基因GUS组织化学染色，表明外源基因已经整合到受体细胞的染色体中并表达。

2.根据权利要求1 所述的方法，其特征在于，步骤（1）所述的红豆杉愈伤组织诱导培养基为：B5培养基+TDZ(0.5-2.0 mg/l)+2,4-D(1.0-2.0 mg/l)+NAA(1.0-2.0 mg/l)+蔗糖25 g/l+植物凝胶5 g/l；其中，组分后的数字为该组分在B5培养基单位体积（l）中的加入量（g），下同，不再作一一说明。

3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤（2）所述的胚性愈伤诱导培养基为：B5培养基+TDZ(0.5-2.0 mg/l)+2,4-D(1.0-2.0 mg/l)+NAA(1.0-2.0 mg/l)+酪氨酸0.8 g/l+丙氨酸0.4 g/l+脯氨酸0.4 g/l+赖氨酸0.4 g/l+谷氨酸0.4 g/l+蔗糖25 g/l+植物凝胶5 g/l。

4.根据权利要求1所述方法，其特征在于，步骤（4）所述的恢复培养基的组分为：B5+TDZ(0.5-2.0 mg/l)+2,4-D(1.0-2.0 mg/l)+NAA(1.0-2.0 mg/l)+酪氨酸0.8 g/l+丙氨酸0.4 g/l+脯氨酸0.4 g/l+赖氨酸0.4 g/l+谷氨酸0.4 g/l+蔗糖25 g/l+植物凝胶5 g/l+羧苄霉素250 mg/l。

5.根据权利要求1所述方法，其特征在于，步骤（4）所述的愈伤组织筛选培养基为：B5培养基+TDZ(0.5-2.0 mg/l)+2, 4-D(1.0-2.0 mg/l) +NAA (1.0-2.0 mg/l)+酪氨酸0.8 g/l+丙氨酸0.4 g/l+脯氨酸0.4 g/l+赖氨酸0.4 g/l+谷氨酸0.4 g/l+蔗糖25 g/l+植物凝胶5 g/L+250 mg/L羧苄霉素＋5 mg/L潮霉素。

6.根据权利要求1所述方法，其特征在于，步骤（4）所述的继代培养基的组分为：B5培养基+TDZ(0.5-2.0 mg/l)+2,4-D(1.0-2.0 mg/l)+NAA(1.0-2.0 mg/l)+酪氨酸0.8 g/l+丙氨酸0.4 g/l+脯氨酸0.4 g/l+赖氨酸0.4 g/l+谷氨酸0.4 g/l+蔗糖25 g/l+植物凝胶5 g/l＋5 mg/l潮霉素。