[发明专利]一种获得红豆杉转基因愈伤组织的遗传转化方法

说明书

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种获得红豆杉转基因愈伤组织的方法。

背景技术

红豆杉(Taxussp.)又称紫杉，为红豆杉科(Taxaceae)红豆杉属(Taxus)的裸子植物。红豆杉属植物全世界共有11种，主要分布于北半球温带至亚热带地区。我国有4种和1个变种，分别是东北红豆杉(T.cuspidata)、云南红豆杉(T.yuennanensis)、中国红豆杉(T.chinensis)、南方红豆杉(T.chinensis var.mairei)、西藏红豆杉(T.wallichiana)(中国科学院中国植物志编辑委员会，1978)，主要分布于东北、西北、华北、西南、中南、华南的各个省区。后来还引种了曼地亚红豆杉(T.x media)，为东北红豆杉和欧洲红豆杉(T.baccata)的杂交种，其母本是东北红豆杉，父本是欧洲红豆杉。

紫杉醇(taxol)是从红豆杉树皮中提取出来的一种天然活性成分，具有独特的抗癌效果，对人卵巢癌、乳腺癌、黑色素癌等多种癌症有突出的疗效，对白血病、肺癌、脑癌和其他的一些实体瘤等也有很好的疗效，毒副作用很小，是最好的天然抗癌药物之一。据估计，全世界紫杉醇的年需求量至少在1 000 kg以上。目前，紫杉醇只存在于裸子植物红豆杉科的红豆杉属的11种（亚种）植物中，而且主要从红豆杉树的茎皮中获得。

但是红豆杉的生长速度缓慢，再生能力差，成材需要50-250年时间。其资源量非常有限，特别是紫杉醇含量低，仅占树皮干重的0.01%～0.02%。红豆杉资源与开发矛盾特别突出。近年来，受利益的驱使，红豆杉的野生资源遭到了严重的破坏。如何扩大紫杉醇的药源已经成为当务之急。红豆杉的人工栽培已取得一定进展，但种植需占大量土地，周期较长。紫杉醇的化学全合成需近30步反应，尚无商业开发价值。植物细胞培养由于不受气候和土壤的限制，是作为生产植物有用次生代谢产物的有效方法。目前红豆杉培养细胞中紫杉醇的产量一般都不高，即使偶尔获得较高的产量也都存在着紫杉醇产量不稳定的问题，所以要利用基因工程的方法对紫杉醇生物合成与分支途径中有关基因进行调控，以提高红豆杉培养细胞中紫杉醇产量及其稳定性成为了当前的研究热点。国内外不少实验室正在进行这方面的研究，但还没有成功的报道。诱导培养红豆杉胚性愈伤，以根癌农杆菌为介导，获得红豆杉转基因愈伤组织的方法，将是开展紫杉醇代谢工程研究提高紫杉醇含量并最终解决紫杉醇产品稀缺的有效方法。目前尚未发现获得红豆杉转基因愈伤组织的相关报道。

发明内容

本发明的目的在于克服现有技术中的不足，提供一种简单、快速、高效地获得红豆杉转基因愈伤组织的方法。

本发明提供的获得红豆杉转基因愈伤组织的方法，包括红豆杉外植体的培养、胚性愈伤组织的诱导和增殖培养、以根癌农杆菌为介导的转化，具有抗性的愈伤组织的筛选和增殖培养及愈伤组织GUS基因的检测等，为紫杉醇愈伤组织大规模工厂化生产奠定了坚实的基础。

本发明利用红豆杉下胚轴作为外植体诱导愈伤组织，并经过培养获得胚性愈伤，用根癌农杆菌介导，将带有GUS基因的pCAMBIA1304质粒导入红豆杉愈伤组织，PCR检测外源潮霉素磷酸转移酶基因(Hygromycin B phosphotransferase gene, HPT)的整合情况，用组织化学方法检测GUS基因在组织中的表达情况，获得红豆杉的转基因愈伤组织。

具体步骤为：

(1) 红豆杉愈伤组织的诱导培养：选择下胚轴为愈伤组织诱导用外植体，在愈伤组织诱导培养基上进行暗培养，在下胚轴两端逐渐产生白色的愈伤组织，并且不断膨大。上述愈伤组织诱导培养基是以B5培养基为基础，再添加激素NAA、TDZ和2,4-D而组成。

(2) 红豆杉胚性愈伤组织的诱导培养：将下胚轴诱导出的白色愈伤转接入胚性愈伤诱导培养基上，预防水样化和褐化，并获得致密的、硬度增加的胚性愈伤组织。该胚性愈伤诱导培养基是以B5培养基为基础，再添加5种氨基酸和激素2,4-D、NAA和TDZ 而组成。

(3) 遗传转化：利用根癌农杆菌介导法，将含GUS基因的植物表达载体pCAMBIA1304根癌农杆菌，以红豆杉胚性愈伤组织为受体进行遗传转化。 

(4) 抗性胚性愈伤组织的脱菌、筛选和增殖培养：经过遗传转化，然后，在恢复培养基上进行脱菌培养，在筛选培养基上进行筛选培养，获得具有潮霉素抗性的愈伤组织；将抗性愈伤组织接入胚性愈伤组织继代培养基进行增殖培养，增加抗性愈伤组织的数量。