[发明专利]核壳结构球形致孔剂及其用于制备三维细胞支架

说明书

技术领域：

本发明属于生物材料领域，特别涉及一种核壳结构球形致孔剂及其用于制备三维细胞支架。

背景技术：

三维细胞支架为种子细胞提供生长模板，引导组织再生，控制组织或器官的形状，它在组织工程学起着关键性的作用。组织工程所用的细胞支架需要具有适宜的孔隙形状、结构、大小、孔隙率和良好的孔隙连通性。以聚乙烯醇弹性微球为致孔剂的压滤成型/粒子沥滤法（Qi Q Q, Chen J D , Gao S Z, et al. Preparation cell scaffolds with well defined pore structure through elastic porogen/pressure filtration [J]. Advanced materials research, 2011, 236-238:1897-1901），通过调节致孔剂大小、压缩比例实现了控制支架内部孔隙的大小、孔隙间通道尺寸，但是，聚乙烯醇微球在微波加热过程中不能完全除尽；制备出的聚乙烯醇微球强度低，在压滤成型过程中，微球变形性随空间位置变化，当支架体积较大时，支架孔隙结构的均匀性较差、重现性不高，孔隙参数不能由实验条件调节与控制，不利于工业化生产。

发明内容：

本发明的目的是为了解决压滤成型/粒子沥滤法制备支架中致孔剂的不足，提供一种外层具有一定弹性、内层强度较高的微球，即核壳结构的致孔剂，并利用该致孔剂与压滤成型粒子/沥滤技术结合制备孔隙结构参数可控的三维多孔细胞支架。

本发明所涉及的核壳结构球形致孔剂是通过下述方法获得：其具体步骤如下： 

第一步 在砂磨机中配制碳酸钙/海藻酸钠悬浮液；

第二步 将第一步制得的悬浮液吸入注射器中，放置于注射泵上，在高压静电体系中的条件为:电压在8-10kv，电极间距离为2cm；流速为10mL/h，针头内径为0.55mm，将液滴滴入固化液氯化钙浓度为20%，固化交联完全后，得到碳酸钙/海藻酸钙复合微球，即致孔剂微球的核，其粒径在200-1000μm；

第三步 将第二步制得的微球过滤，用蒸馏水反复冲洗数次后，用无水乙醇除去微球表面的多余的水分，将微球置于自制的沸腾干燥装置中，用压缩空气干燥至无水，筛分微粒，得到需要粒径的微粒；

第四步 称取第三步得到需要粒径的微粒，置于盛有EDTA溶液的烧杯中，反应至设定时间后，迅速过滤致孔剂，并转入20%的氯化钙溶液中浸泡1h，过滤，用蒸馏水反复冲洗至无游离钙离子，即获得核壳结构的致孔剂。

本发明的另一方面是将致孔剂微球用于制备三维细胞支架，其具体步骤为： 

第一步 配制PDLLA支架溶液；

第二步 将支架制备溶液、模具、致孔剂等置于三氯甲烷/二氧六环(V/V=5:2)蒸汽饱和的密闭操作箱内，在操作箱内，将核壳致孔剂与支架溶液按1:1(V/V)混合均匀，转入支架制备模具内，用分布有微孔的压滤板对混合物施压；

第三步 将致孔剂/支架溶液复合物连同磨具迅速置于-45 ℃低温环境，冷冻、固化定型18h及以上；

第四步 迅速脱模后用冷冻干燥机干燥7 h；

第五步 将复合物浸入蒸馏水中30min；

第六步 将步骤⑤中的复合物取出用刀切去上下面，浸泡在用2mol/L 的EDTA溶液(pH=10)溶解致孔剂，每12h更换一次EDTA溶液，如此反复更换三次；

第七步 取出三维支架，用蒸馏水冲洗，充分干燥后获得多孔PDLLA支架。

本发明所涉及的具有核壳结构的致孔剂克服了压滤成型/粒子沥滤法制备支架中致孔剂的缺点，致孔剂的外层海藻酸钙凝胶具有一定弹性、内层碳酸钙/海藻酸钙强度较高的微球，采用该种致孔剂制备的多孔支架的孔隙参数可以方便地由实验条件调节与控制，且制备工艺适合于工业化生产。 

附图说明：

图1是粒径为200-1000微米的核壳球形微球致孔剂的形貌显微镜照片；

图2是致孔剂与支架材料复合物的外观照片；

图3是三维细胞支架的外观；

图4是点光源透过多孔支架；

图5是三维支架孔隙的细胞支架的扫描电镜图片（28倍）；

图6是三维支架孔隙的细胞支架的扫描电镜图片（100倍）；

图7是三维支架孔隙的细胞支架的扫描电镜图片（301倍）。

具体实施案例：