[发明专利]一种重组工程介导的大肠杆菌基因组点突变的方法

权利要求书

1.一种基于重组工程的大肠杆菌基因组点突变的方法，其特征在于，包括以下步骤：

（1）通过重叠－延伸聚合酶链式反应获得一个DNA修饰片段，所述DNA修饰片段依次由下列结构组成：与基因组上位点待突变靶位点上游50bp序列一致的左端50bp同源臂、突变位点、与靶位点下游30bp序列一致的30bp同源片段、两侧为两个归巢核酸酶I-SceI酶切位点的卡那霉素抗性基因和与靶位点下游50bp序列一致的右端50bp同源臂所组成；

（2）将含重组酶基因和I-SceI基因的质粒pLS134转化至大肠杆菌MG1655中；所述的质粒pLS134是将PCR扩增的tetR-ptetA-I-SceI基因盒片段以NsiI酶切后，克隆至pBAD322的NsiI位点，得到重组克隆pLS133；再将exo，bet和gam三个重组酶基因从lambda噬菌体DNA中PCR扩增后，以NcoI和XhoI酶切后，克隆至pLS133的NcoI和SaII位点，得到目的质粒pLS134；

（3）将步骤（1）得到的DNA修饰片段电转化至以终浓度为0.15%的L-阿拉伯糖诱导下表达Red重组酶基因的步骤（2）的大肠杆菌电转化感受态细胞中，通过重组酶介导的同源臂和大肠杆菌基因组上相同序列之间的同源重组，将所述DNA修饰片段中，左右50bp同源臂之间的片段整合至大肠杆菌基因组，在卡那霉素抗性筛选之下，获得整合有突变位点、30bp同源片段和两侧为I-SceI酶切位点的卡那霉素抗性基因的卡那霉素抗性突变株；

（4）将步骤（3）得到的菌株在含终浓度为20μg/ml热处理的氯四环素的培养基中进行培养，热失活的氯四环素诱导I-SceI酶的表达，I-SceI酶作用于整合在基因组上的I-SceI酶切位点，基因组发生双链断裂，促使菌株利用自身的重组功能催化30bp同源片段与靶位点下游30bp之间发生同源重组，从而将30bp同源片段、两个I-SceI酶切位点及卡那霉素抗性基因消除，最终获得发生点突变的大肠杆菌突变株。

2.如权利要求1所述的方法，其特征在于所待突变位点和突变位点是一个或多个碱基。

3.如权利要求1所述的方法，其特征在于，首先通过一个聚合酶链式反应得到含左侧50bp同源臂、突变位点、30bp同源片段、一个I-SceI酶切位点和5'端卡那霉素抗性基因的DNA片段，再通过另外一个PCR反应得到3'端卡那霉素抗性基因、一个I-SceI酶切位点和右侧50bp同源臂的DNA片段，在5'端卡那霉素抗性基因和3'端卡那霉素抗性基因之间含21bp的重叠序列；随后通过重叠－延伸聚合酶链式反应获得两侧为50bp同源臂的含突变位点、30bp同源片段以及两侧为I-SceI酶切位点的卡那霉素抗性基因的融合DNA修饰片段。

4.如权利要求1所述的方法，其特征在于，同源臂用于通过重组酶催化的同源重组将含突变位点的DNA修饰片段整合至大肠杆菌的基因组；右侧的50bp同源臂为靶位点下游的50bp序列，此50bp序列的前30bp为同源片段；30bp同源片段用于同源重组以去除一段30bp序列、两个I-SceI酶切位点及卡那霉素抗性基因的冗余序列，所得变株的基因组不含突变位点外任何序列。

5.如权利要求1所述的方法，其特征在于，重组酶基因是来自于lambda噬菌体的exo，bet和gam基因，重组酶基因是克隆在受L-阿拉伯糖所诱导启动子之下；I-SceI基因克隆在受热处理的氯四环素诱导的启动子之下。含重组酶基因和I-SceI基因的质粒pLS134游离于大肠杆菌MG1655的基因组。